ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Ambiente genético del Gen bla_CTX-M-12 en aislamientos hospitalarios de Klebsiella pneumoniae

The bla_CTX-M-12 gene's genetic environmnt in Klebsiella pneumoniae hospital isolates

Yamile Adriana Celis Bustos , Ingrid Yamile Pulido Manrique, Emilia María Valenzuela de Silva, María Teresa Reguero Reza, José Ramón Mantilla Anaya¹

¹ Laboratorio de Epidemiologia Molecular, Instituto de Biotecnologia, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá

Recibido: febrero 10 de 2009 Aprobado: junio 16 de 2009

En Colombia se han detectado genes del grupo CTX-M-1 con alta frecuencia en aislamientos de Klebsiella pneumoniae causantes de infección intrahospitalaria. El conocimiento de los factores genéticos que pueden favorecer la diseminación de estos genes entre especies bacterianas es un aspecto importante para el control de la resistencia. En este estudio se identificaron los plásmidos portadores del gen bla_CTX-M-12 en 21 aislamientos clínicos de K. pneumoniae. Se evaluó por conjugación la transferencia de resistencia a antibióticos. Integrones, secuencias de inserción y otros elementos genéticos fueron detectados por amplificación del ADN plasmídico con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mediante análisis por PCR se determinó la relación entre el gen bla_CTX-M-12 y los elementos genéticos detectados. En todos los aislamientos, el gen bla_CTX-M-12 se encontró en plásmidos conjugativos de tamaños entre 65 y 106 kpb. La transferencia por conjugación de estos elementos móviles puede explicar la amplia diseminación de este gen entre enterobacterias causantes de infección nosocomial en hospitales de Bogotá, Colombia. El gen bla_CTX-M-12 se encontró corriente abajo de ISEcp1, secuencia de inserción que se ha asociado con la movilización de determinantes genéticos de resistencia. Los promotores de ISEcp1, detectados por análisis de secuencia, pueden facilitar la expresión de la cefotaximasa codificada por este gen.

Palabras clave: resistencia a antibióticos, elementos genéticos móviles, gen bla_CTX-M-12, plásmidos conjugativos, Klebsiella pneumoniae.

Abstract

Key words: antibiotic resistance, mobile genetic element, the bla_CTX-M-12 gene, conjugal plasmid, Klebsiella pneumoniae.

Introducción

La resistencia a antimicrobianos se ha convertido en un problema global debido a la amplia diseminación de diversos genes de resistencia entre especies bacterianas causantes de infección. Con el incremento del uso de cefalosporinas de tercera generación surgieron, por selección, cepas bacterianas con capacidad de expresar diferentes clases de ß-lactamasas de espectro extendido (BLEE). Dentro de este grupo de enzimas, las cefotaximasas del tipo CTX-M son consideradas actualmente como las más diseminadas en el mundo (Jacoby et ál., 2005; Bonnet, 2004; Cantón et ál., 2008; Livermore et ál., 2008). Klebsiella pneumoniae, productora de BLEE, es la especie causante de infección nosocomial más frecuente en América Latina (Villegas et ál., 2008). En Bogotá Colombia, el grupo de Epidemiología Molecular de la Universidad Nacional de Colombia ha encontrado alta prevalencia de genes que codifican para cefotaximasas del grupo CTXM- 1 y, entre éstos, el gen bla_CTX-M-12 fue el que se encontró en mayor proporción en aislamientos de K. pneumoniae causantes de infección intrahospitalaria (Leal et ál., 2003; Mantilla et ál., 2004; Mantilla et ál., 2006; Valenzuela et ál., 2006). Este gen, descrito inicalmente por Kariuki en áfrica (Kariuki et ál., 2001), fue detectado por primera vez en Colombia en aislamientos de K. pneumoniae causantes de un brote en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) de un hospital de tercer nivel de Bogotá (Leal et ál., 2003).

Algunos de los genes que codifican para estas ß-lactamasas se localizan en plásmidos que a menudo contienen otros genes de resistencia, tales como los genes qnr que confieren resistencia a fluoroquinolonas, genes aacC2, strA y strB a aminoglicósidos, catA2 a cloramfenicol, sul1 a sulfonamidas y dfrA14 a trimetoprim, entre otros (Ying-Tsong Chen et ál., 2006); en estos plásmidos también se han encontrado elementos genéticos tales como secuencias de inserción, integrones y transposones que pueden estar involucrados en el reclutamiento de genes de resistencia a diferentes clases de antibióticos, en la movilización y expresión de la multirresistencia (Poirel et ál., 2008; Bennett et ál., 2008; Cantón et ál., 2006).

Los determinantes genéticos asociados con corresistencias pueden estar incluidos en la misma estructura genética, como en las denominadas islas de patogenicidad y de resistencia, descritas para diversas especies bacterianas, o encontrarse asociados con plataformas genéticas móviles (Depardieu et ál., 2007). Entre las plataformas móviles más comúnmente descritas como portadoras de genes de resistencia se encuentran los plásmidos, elementos genéticos extracromosomales en los que se pueden ensamblar genes que les proporcionan a las bacterias características importantes para su supervivencia. Los plásmidos pueden poseer o integrar elementos genéticos que permiten el reclutamiento de genes de resistencia y a su vez pueden servir como vehículos para la disemiminación de dichos genes por procesos de transformación o conjugación (Bennet et ál., 2008).

El objetivo de este estudio fue describir el entorno genético del gen bla_CTX-M-12 detectado en aislamientos hospitalarios de K. pneumoniae resistentes a múltiples antibióticos (MR). El conocimiento de las características moleculares que se encuentren asociadas con este determinante genético de resistencia será importante para el control de la resistencia a antibióticos.

Materiales y métodos

Se evaluaron 21 aislamientos de Klebsiella pneumoniae causantes de infección hospitalaria, recolectados entre los años 2005 al 2007 en hospitales de tercer nivel de Bogotá, Colombia. Todos los aislamientos eran portadores del gen bla_CTX-M-12 identificado por Polimorfismo Conformacional de Cadena Sencilla (SSCP) y secuenciación (Velandia, 2008).

Susceptibilidad a antibióticos

Ensayos de transferencia de resistencia

La conjugación se realizó en medio líquido de acuerdo con lo descrito por Eckert (Eckert et ál., 2006) utilizando como cepa receptora la Escherichia coli CAG12177 resistente a ácido nalidíxico. Se compararon los perfiles plasmídicos de los aislamientos donantes y de los respectivos transconjugantes obtenidos. Se evaluó la transferencia del gen de interés, mediante amplificación por PCR del gen empleando como molde ADN total y del ADN plasmídico de los transconjugantes. Además, se evaluó la transferencia de la resistencia, utilizando sensidiscos de los siguientes antibióticos: cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona, aztreonam, ampicilina, piperacilina, gentamicina y amikacina.

Detección de genes codificantes de b-lactamasas

La detección de genes bla_CTX-M que codifican cefotaximasas del grupo CTX-M-1 se realizó mediante amplificación por PCR, en 15 µl del volumen de reacción que contenía, 1 µM de cada uno de los iniciadores referenciados en la tabla 1, 1,5 mM de MgCl₂, 0,2 mM de dNTP, 0,04 Unidades de Taq-ADN polimerasa por µL de reacción en solución amortiguadora 1X suministrada por Invitrogen, y aproximadamente 10 ng de ADN total o de ADN plasmídico. La reacción se realizó en un termociclador iCycler® (Biorad Laboratories), mediante desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 55 °C y 1 min a 72 °C, seguidos de 5 min de extensión final a 72 °C. Para la obtención del ADN total de las muestras se utilizó la técnica de lisis celular por calentamiento en baño de agua en ebullición informada por Chanowang et ál. (2002), y el ADN plasmídico como se describe adelante.

Extracción de plásmidos y evaluación de plásmidos portadores del gen blaCTX-M-12

El ADN plasmídico fue obtenido por el método de termólisis alcalina: las células de 10 ml de un cultivo en caldo LB con absorbancia 0,7 a 600 nm fueron suspendidas en 100 µl de solución de pre-lisis (glucosa 50 mM, EDTA 10 mM, Tris.HCl 25 mM, pH 8,0) luego se mezclaron con 200 µl de solución de lisis (Tris 50 mM, SDS 4% pH 12,6) e incubaron a 65 °C durante 30 min. Se adicionó un volumen de fenol-cloroformo-isoamílico (25:24:1), se mezcló por inversión suave durante 5 min, y se centrifugó a 4° C durante 20 min a 20.000 g. El ADN plasmídico de la fase acuosa se separó por electroforesis en geles de agarosa al 0,8% en buffer TAE 1X (Tris acetato 40mM, EDTA 1mM) y bromuro de etidio 1µg/ml, bajo las siguientes condiciones: una hora a 1 vol/cm, dos horas a 1,8 vol/cm y tres horas a 3 vol/cm. El registro fotográfico, digitalización y análisis del tamaño de los plásmidos se realizó con el programa Quantity One® y el digitalizador Gel Doc® de Biorad

Para la detección por PCR de los genes de resistencia en el ADN plasmídico separado por electroforesis, la porción de agarosa con cada una de las bandas de ADN separadas se pesó en un tubo de microcentrífuga, se adicionaron 10 volúmenes de agua desionizada esterilizada, se calentó durante 5 min a 94 °C, se homogeneizó durante 10 segundos en "vórtex" e inmediatamente se utilizaron 3 µl para un volumen de reacción de 15 µl bajo las condiciones de amplificación por PCR descritas anteriormente.

Para determinar el tamaño de los plásmidos obtenidos por termolisis alcalina, 50 µl de la fase acuosa (aproximadamente 1 µg de ADN), fueron digeridos con 1 unidad de nucleasa S1 (Invitrogen) a 37 °C durante 10 a 20 min, bajo las condiciones descritas (Ausubel et ál., 2003). Se adicionó 1µl de EDTA 0,5 M para detener la acción de la nucleasa. Los plásmidos en forma lineal se separaron mediante electroforesis en gel de campos pulsados (PFGE).

La detección de elementos genéticos que aparecen en la tabla 1, que se han encontrado asociados con genes blaCTX-M y a otros genes de resistencia (Levesque et ál., 1995; Lartigue et ál., 2004; Eckert et ál., 2006), se realizó mediante amplificación por PCR de ADN plasmídico. Para establecer la asociación de los elementos genéticos detectados y su posición con respecto al gen bla_CTX-M-12 se utilizaron 6 pares de iniciadores (ver tabla 1) utilizando la estrategia de "mapeo por PCR". Así, la ubicación corriente arriba del gen bla_CTX-M-12 se determinó combinando los iniciadores directos de los determinantes genéticos detectados (ISEcp1, IS26, ISCR1) con el iniciador reverso CTX-MB. Para conocer el ambiente genético de la región corriente abajo, se combinaron los iniciadores reversos de las secuencias IS903, qacEΔ, sulI con el iniciador directo CTX-MA. Para la estrategia de "mapeo por PCR" se utilizaron las mismas condiciones de amplificación usadas para la detección de genes bla_CTX-M-12 previamente descritas.

Resultados y discusión

Perfil de susceptibilidad a antibióticos, transferencia de resistencia por conjugación y evaluación de plásmidos portadores del gen blaCTX-M-12

El perfil de susceptibilidad de los 21 aislamientos de Klebsiella pneumoniae incluidos en el estudio mostró que 16 de los aislamientos presentaban resistencia a más de cuatro grupos de antibióticos por lo que se consideraron multirresistentes. Todos fueron resistentes a rifampicina, a ß-lactámicos de amplio espectro (ampicilina, piperacilina), al monobactámico aztreonam y a las cefalosporinas de tercera generación, cefotaxima y ceftriaxona; frente a ceftazidima fueron resistentes 16/21, y a cefepime (cefalosporina de cuarta generación) fueron resistentes 17 de los 21 aislamientos. La resistencia a aminoglicósidos fue 19/21 a estreptomicina, 12/21 a amikacina y 8/21 a gentamicina. Con respecto a quinolonas el 4/21 fueron resistentes a ciprofloxacina, 6/21 a ácido nalidíxico; 13 de 21 fueron resistentes a tetraciclina y a trimetoprim-sulfametoxazol. Todos los aislamientos fueron sensibles a imipenem (ver figura 1).

Para poner de manifiesto la transferencia de la resistencia en los 21 aislamientos en estudio se realizaron los ensayos de conjugación. Tres aislamientos no fueron incluidos en los procedimientos de conjugación debido a la falta de una cepa receptora apropiada ya que estos aislamientos presentaron resistencia a los antibióticos que se podían utilizar para la selección de los transconjugantes. Con los dieciocho aislamientos restantes se obtuvieron transconjugantes de Escherichia coli resistentes a cefotaxima, piperacilina y aztreonam. En estos transconjugantes se detectó, por PCR, el gen bla_CTX-M-12, por lo cual es posible afirmar que este gen se encuentra localizado en plásmidos conjugativos y que la resistencia a los antibióticos antes mencionados se debe a la expresión por E. coli de la cefotaximasa CTX-M-12. Dichos plásmidos presentaron tamaños que oscilan entre 52 y 106 kpb aproximadamente (tabla 2). Este resultado confirma la participación de plásmidos conjugativos en la diseminación de genes que codifican para cefotaximasas entre aislamientos de Klebsiella pneumoniae y posiblemente pueden estar involucrados en la movilización de estos genes a otras especies de enterobacterias. La presencia del gen bla_CTX-M-12 en plásmidos de alto peso molecular detectados en este estudio contrasta con lo informado por Bae et ál. (2006) con respecto al gen blaCTXM- 12, detectado en tres aislamientos de Escherichia coli en un plásmido relativamente pequeño de aproximadamente 18 kpb, de igual manera el tamaño de los plásmidos encontrados en los aislamientos incluidos en este estudio fue inferior al informado por Kariuki (2001) en aislamientos de K. pneumoniae con un tamaño de 120kpb.

De las 18 cepas de E. coli transconjugantes que adquirieron el gen bla_CTX-M-12, 11 fueron resistentes a ceftazidima (CAZ) y correspondieron específicamente a las que se obtuvieron por conjugación con los aislamientos de K. pneumoniae resistentes a CAZ. Sin embargo, se ha encontrado que algunas mutaciones puntuales pueden variar la actividad hidrolítica de algunas BLEE del tipo CTX-M, debido a que dichas mutaciones le confirieren a estas variantes una mayor afinidad sobre otras cefalosporinas como ceftazidima y cefepime (Gniadkowski et ál., 2008, Bae et ál., 2006).

La resistencia a cefepime (FEP) -cefalosporina de cuarta generación- fue transferida desde 12 de los 16 aislamientos resistentes a este antibiótico, actividad que no pudo ser atribuida a la cefotaximasa codificada por el gen bla_CTX-M-12. Estudios realizados en Corea (Bae et ál., 2006) con el gen bla_CTX-M-12, obtenido de aislamientos de E. coli, informan actividad hidrolítica sobre FEP por la cefotaximasa codificada por este gen. Sin embargo, los resultados obtenidos en este estudio y por Pulido en el 2006, indican que la actividad sobre cefepime se debe a la acción de los productos de otros genes como los genes blaSHV y blaTEM detectados en algunos de los aislamientos en estudio o por la presencia del gen bla_CTX-M-12 asociado con otros mecanismos de resistencia como pueden ser la sobreproducción de bombas de eflujo o alteraciones en las proteínas de membrana externa (Tran et ál., 2009).

La resistencia al aminoglicósido gentamicina fue transferida por conjugación desde 5 de 7 de los aislamientos resistentes a este antibiótico, y en el caso de la resistencia a amikacina desde 5 de 11 de los aislamientos. En 4 de los 5 aislamientos de E. coli transconjugantes que mostraron resistencia a amikacina, se observó un único plásmido de resistencia, de aproximadamente 65 kpb, en el que se encontró localizado el gen bla_CTX-M-12. La co-transferencia de la resistencia a los dos aminoglicósidos solamente se observó desde un aislamiento que poseía tres plásmidos con tamaños de 10, 65 y 98 kpb. En los demás casos no fue posible asociar el fenotipo de resistencia detectado en los transconjugantes de E.coli con una plataforma de movilización específica, puesto que el perfil plasmídico de los transconjugantes fue idéntico al observado en los aislamientos de origen, y estos a la vez poseen dos o más plásmidos de diferente tamaño (ver tabla 2).

El gen bla_CTX-M-12 de 15 de los aislamientos se encontró ubicado en un plásmido común con un tamaño aproximado 65 kpb, en los otros tres se detectó en plásmidos de 65 a 106 kpb. El hecho de encontrar el gen bla_CTX-M-12 en plásmidos de diferentes tamaños moleculares, indica que estos plásmidos posiblemente han evolucionado por la adquisición de otros elementos genéticos, o que este gen ha sido transferido de un plásmido a otro probablemente por acción de secuencias de inserción o transposones que facilitan dicha movilidad.

Ambiente genético del gen blaCTX-M-12

La secuencia de inserción ISEcp1 se detectó en los 21 aislamientos evaluados y las secuencias de inserción IS26 e IS903 en 17 y 18 respectivamente. En 9 de los aislamientos se detectaron genes de la integrasa clase I (Int1) y el gen de resistencia a desinfectantes de amonio cuaternario (qacE?); el gen de resistencia a sulfonamidas (sulI) en 8 y la ISCR1 en 5 de los aislamientos evaluados. La secuencia de inserción ISEcp1 se ha informado corriente arriba (entre 42 a 266 bp) de varios genes blaCTX-M entre ellos los genes que codifi can para las enzimas CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-3, CTX-M-9, CTX-M-13, CTX-M-14, CTX-M-15, CTX-M-17, CTX-M-19, CTX-M-20, y CTX-M-21 (Cantón et ál., 2006; Bonnet, 2004; Poirel et ál., 2003; Cao et ál., 2002). En este estudio, la secuencia de inserción ISEcp1 se detectó en todos los aislamientos y en todos los plásmidos conjugativos portadores del gen bla_CTX-M-12.

Con la estrategia de "mapeo por PCR" se estableció que el gen bla_CTX-M-12 se encontraba localizado corriente abajo de la secuencia de inserción ISEcp1; el análisis de la secuencia del producto de la amplifi cación de 2.400 pb obtenido en el "mapeo" mostró que la región repetida invertida derecha de ISEcp1 se encontraba localizada corriente arriba del gen blaCTXM- 12. De igual manera, corriente abajo de ISEcp1 se encontraron las secuencias promotoras -35 (TTGAAA) y -10 (TACAAT), que se han descrito como las encargadas de promover la expresión de los genes de resistencia localizados corriente abajo de esta secuencia de inserción, confi rmando lo descrito por otros investigadores que han reportado a esta secuencia de inserción como un factor clave en la diseminación de diferentes genes que codifi can para cefotaximasas CTX-M del Grupo 1 (Cantón et ál., 2006; Bonnet, 2004; Poirel et ál., 2003; Cao et ál., 2002). (Ver figura 2).

Se detectaron otros elementos genéticos en los aislamientos evaluados. En 8 de los 21 se detectó el gen intI1 y el gen qacEΔ. En 6 de estos 8 aislamientos que poseen el gen de integrasa (intI1) se encontró el gen de resistencia a sulfonamidas sul1 y en 5 el elemento ISCR1. Ninguno de los determinantes genéticos antes mencionados se encontró relacionado con el gen bla_CTX-M-12. Los integrones clase 1 y determinantes genéticos relacionados con estos (genes sul1 y qacEΔ) se han descrito asociados a los genes blaCTX-M, de los grupos 2 y 9 (Di Conza et ál., 2002; Sabaté et ál., 2002; Arduino et ál., 2003). En el segmento conservado 3' de estos integrones se encuentra un elemento denominado ISCR1, antes conocido como ORF513, el cual cumple una función similar a la secuencia ISEcp1 en la regulación de la expresión y movilización de los genes de resistencia presentes corriente abajo de esta región común. Se han descrito varios genes de resistencia asociados con este elemento, entre ellos los genes catAII y el gen dfrA10 que confieren resistencia a cloranfenicol y a trimetoprim respectivamente (Ying- Tsang Chan et ál., 2006). Todos los aislamientos en los que se detectó la ISCR1, fueron resistentes a trimetoprim-sulfametoxazol por tanto, los genes determinantes de esta resistencia pueden estar asociados con dicho ORF y forman parte de los integrones de clase 1 detectados.

Conclusiones

El perfil de susceptibilidad mostró que todos los aislamientos de K. pneumoniae investigados presentaban resistencia a cefalosporinas de tercera generación entre otros grupos de antibióticos. Dicha resistencia es causada por la presencia del gen bla_CTX-M-12 que se encontró en plásmidos conjugativos de alto peso molecular. Esta puede ser una de las causas de la diseminación de estos genes de resistencia entre enterobacterias causantes de infección intrahospitalria.

El gen bla_CTX-M-12 se encontró corriente abajo de la secuencia de inserción ISEcp1, la cual contribuye en los procesos de movilización y expresión de este gen. En un alto porcentaje de los aislamientos evaluados se detectaron las secuencias de inserción IS26 e IS903 pero no se encontraron asociadas con el gen bla_CTX-M-12, lo que permite presumir que estas secuencias de inserción pueden estar asociadas con otros genes de resistencia.

Este trabajo fue realizado gracias a la División de Investigaciones de Bogotá (DIB) de la Universidad Nacional de Colombia, y a Colciencias por la financiación del proyecto.

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