Artículo original

¹ Universidad de Córdoba, Facultad de Ciencias Agrícolas, Departamento de Ingeniería de Alimentos, Montería, Colombia

² Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Instituto de Investigaciones Biológicas del Trópico, Montería, Colombia

Resumen

Objetivo. Detectar Salmonella spp. por PCR en tiempo real (PCR-TR) y el método convencional en alimentos de la vía pública y canales de bovino de una planta certificada de beneficio animal con sistema HACCP de Montería.

Materiales y métodos. Se analizaron 311 muestras de alimentos: 256 de la vía pública y 55 de una planta de beneficio animal. Los análisis microbiológicos se realizaron por el método estándar convencional y la PCR-TR con LightCycler® foodproof Salmonella detection kit (Roche Diagnostics).

Resultados. Se aisló Salmonella spp. en 16,1% de las muestras. La prueba de χ²mostró significancia estadística entre las técnicas (p<0,001); se obtuvo 68% de casos positivos con la PCR-TR y 48% con el método convencional. Los alimentos expendidos en la vía pública que presentaron mayor contaminación por Salmonella spp. fueron: chorizos, con 28,1% por PCR-TR y 12,3% por el método convencional; quesos, con 18,4% por PCR-TR y 5,3% por el método convencional; cerdo, con 23,1% por PCR-TR y 15,4% por el método convencional, y carne molida, con 9,3% por PCR-TR y 15,6% por el método convencional. En canales de bovinos la presencia de Salmonella spp. fue de 1,8%. Se observó diferencia con respecto al tiempo empleado por cada una de las técnicas: la de PCR-TR permitió obtener resultados a las 24 horas, en comparación con los cuatro días del método convencional.

Conclusiones. PCR-TR es una valiosa alternativa para determinar Salmonella spp., en alimentos por su especificidad y rapidez. También es importante la alta presencia de Salmonella en los alimentos callejeros representa un problema de salud pública para los consumidores.

Palabras clave: Salmonella, alimentos, PCR tiempo real (RT-PCR), carnes, HACCP.

Abstract

Objective: To establish Salmonella spp. by real-time PCR (RT-PCR) and standard microbiological method in public fastfood outlets and cattle carcasses from a profit animal plant (PBA-slaughterhouse) certified with the HACCP system in the city of Montería.

Materials and methods: 311 food samples were analyzed: 256 from public fastfood outlets and 55 from a PBA (slaughterhouse). The microbiological tests were conducted by the standard method, the molecular detection RTPCR was carried out by LightCycler® foodproof Salmonella detection kit (Roche Diagnostics).

Conclusions: The study showed that RTPCR is a valuable alternative to determine Salmonella spp. in foods for their specificity and promptness, furthermore, the high presence of Salmonella in public fastfood outlets is a public health problem for consumers.

Key words: Salmonella, food, real time PCR (RT- PCR), meats, HACCP.

Introducción

La salmonelosis es una zoonosis de distribución mundial. Las infecciones por Salmonella spp. pueden causar pequeños brotes en la población; entre 60% y 80% de los casos son esporádicos; a veces se producen grandes brotes en hospitales, jardines infantiles, hogares geriátricos y restaurantes ⁽¹⁾. En Colombia, en el año 2005, se reportaron por el Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Pública, SIVIGILA (Ministerio de la Protección Social, Instituto Nacional de Salud) 7.941 casos de enfermedades trasmitidas por alimentos. Los productos alimenticios comúnmente asociados a los brotes fueron: pescados (22%), agua (20%) y carnes de ganado (14%). Según los datos, Salmonella spp., fue la bacteria que más brotes causó, con un 20% del total de los reportados ⁽²⁾. Estudios previos realizados en la ciudad de Montería, han reportado un 10.3% de Salmonella spp., en alimentos de ventas callejeras y de plazas en mercados ⁽³⁾.

La vigilancia de este patógeno en todas las etapas en la cadena de procesamiento de alimentos, constituye un elemento importante en la investigación de la epidemiología de la salmonelosis. El mercado nacional e internacional, para proteger la salud de sus compradores, exige que todos los productos de consumo estén libres de patógenos como Salmonella spp. ⁽⁴⁾.

Se han hecho grandes esfuerzos en materia de prevención para el control de las enfermedades trasmitidas por alimentos por parte de las industrias y de las entidades encargadas del control. Muchos países, como Estados Unidos, Canadá y Colombia, tienen establecido dentro de su legislación “cero tolerancia” para este patógeno ⁽⁵⁾. En función de dicha legislación, es necesario implementar técnicas rápidas y muy sensibles en el control de la industria, antes de la liberación de los alimentos al mercado. La implementación de los métodos moleculares es necesaria, ya que las técnicas microbiológicas convencionales toman de 4 a 6 días para la detección y la identificación de Salmonella (6-8)spp.

El avance en la biotecnología ha permitido el desarrollo de diversos métodos alternativos, los cuales proporcionan ventajas en cuanto a eficiencia, sensibilidad y disminución del tiempo de detección. Estos métodos rápidos, por estar basados en la determinación de ácidos nucleicos, tienen la potencialidad de ser muy específicos. Tal es el caso de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la técnica PCR-TR (real time PCR), ambas tecnologías moleculares basadas en la amplificación in vitro del ADN; esta última tiene la ventaja de que lleva a cabo simultáneamente los procesos de amplificación y detección en el mismo vial y que determina la cantidad de ADN sintetizado en cada momento de la reacción ^(9-16).

El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia de Salmonella spp. en canales de bovinos de una empresa procesadora de carnes con sistema HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points) y en alimentos expendidos en la vía pública, mediante la técnica PCR-TR y el método convencional.

Materiales y métodos

Cálculo del tamaño de las muestras de los alimentos de la vía pública. Para calcular el tamaño de la muestra, se tuvieron en cuenta los datos suministrados por la Cámara de Comercio que informó que, hasta el 2001, se tenían inscritos 300 restaurantes en Montería. Debido a que no existían datos recientes del DANE sobre el número de ventas callejeras que se encuentran en los diferentes puntos de la ciudad, se aumentó en 10% el número de ventas callejeras y se estableció una muestra total de 330 establecimientos.

Para calcular el tamaño de la muestra se tomaron los siguientes parámetros: frecuencia esperada de contaminación alimentaria de 15%, error máximo aceptable de 1% y nivel de confianza de 99,0% (Epi-Info, CDC, GA, Atlanta, USA, versión 6.0, 2002). Se empleó un muestreo no probabilístico por conveniencia, conformado por 256 muestras de alimentos tomados de diferentes sitios de ventas de comidas callejeras de Montería. De los alimentos analizados, algunos estaban listos para consumir (26,6%), a excepción de las carnes crudas de res, pollo y cerdo (73,3%).

Cálculo del tamaño de las muestras de los alimentos en la planta de beneficio animal. Para calcular el tamaño de la muestra se tuvieron en cuenta las normas establecidas por la empresa, la cual autorizó la toma de 20% del total de número de animales sacrificados, cuyo promedio mensual fue de 280 reses. Se empleó un muestreo no probabilístico por conveniencia.

Tamaño y recolección de la muestra. Los alimentos analizados en este estudio fueron canales de bovinos y productos elaborados a base de carne de res, cerdo y queso. Se analizaron 311 muestras, de las cuales, 256 (82,3%) pertenecían a alimentos de la vía pública y 55 (17,7%) a canales de bovino beneficiados en una planta de beneficio animal certificada con el sistema HACCP. Las muestras de canales bovinos fueron tomadas durante el proceso de sacrificio, en la etapa de refrigeración, realizando un corte de tejido en la espalda y en el pecho de las canales; esta etapa es catalogada como un punto crítico de control dentro del análisis de peligros para la implementación del HACCP en la planta de beneficio animal.

Procedimiento microbiológico para el aislamiento de Salmonella spp. El aislamiento y la identificación se hicieron según los protocolos convencionales previamente descritos ⁽³⁾. Se pesaron 25 g de cada muestra y se inocularon en 225 ml de agua con peptona, la cual se incubó a 37 ºC durante 24 horas. A partir de éste, se inoculó 1 ml de cada muestra en 10 ml de caldo Rappaport y tetrationato (Oxoid, Basingstoke, UK). Posteriormente, se cultivaron en agar XLT4, Salmonella-Shigella-SS, Hekctoen, dexosicolato de lisina y xilosa-XLD (Oxoid, Basingstoke, UK), los cuales se incubaron a 37 ºC por 24 horas. Las colonias sospechosas se identificaron con pruebas bioquímicas convencionales y pruebas serológicas bajo el esquema rutinario de Kauffman-White ⁽³⁾.

Procedimiento PC-TR. Para la extracción del ADN se pesaron 25 g de cada muestra y se inocularon en 225 ml de agua con peptona, la cual se incubó a 37 ºC durante 24 horas. A partir de éste, se transfirieron 50 µl de cada muestra a los tubos de microcentrífuga que contenían la solución de extracción y de lisis ⁽⁷⁾. Posteriormente, se colocaron en baño de maría por 15 minutos a 87 ºC y se dejaron enfriar durante un minuto a 18 ºC; luego se centrifugaron a 8.000 rpm durante un minuto para recuperar el ADN purificado (Shortprep Food Proof Kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany).

Después de extraído el ADN bacteriano directamente del alimento, se tomaron 5 µl del sobrenadante y se le adicionaron 15 µl del PCR mix compuesto por 13 µl de master mix sondas Hybprobe más ADN de salmonella más control interno específico para Salmonella, 1 µl de solución de enzima, 1 µl control interno, la mezcla del ADN y PCR mix se centrifugó a 3.000 rpm durante 3 segundos ⁽⁷⁾. Los resultados de la amplificación se compararon con un control positivo representado por un estándar de Salmonella incluido en el kit ⁽⁷⁾ y un control negativo en el cual el ADN de la muestra fue reemplazado por 5 µl de agua estéril. La técnica de PCR en tiempo real se llevó a cabo según el protocolo LightCycler® foodproof Salmonella detection kit ⁽⁷⁾, el cual consistió en 47 ciclos compuestos por tres pasos, desnaturalización (95 ºC por 2 minutos), anillamiento (40 ºC por 30 segundos) y amplificación (72 ºC por 35 segundos) en el equipo LightCycler 1.5 Instrument (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) ⁽⁷⁾.

Análisis estadístico. Los datos se recolectaron mediante un formulario estandarizado y se tabularon en una hoja electrónica de MS Excel®. Se utilizaron las herramientas de análisis de datos de este programa para elaborar la estadística descriptiva. Posteriormente, se trasladaron al programa estadístico SPSS® v 13, para el análisis de la significancia de las diferencias encontradas en los métodos comparados (PCR-RT y método convencional), se utilizó la prueba de ji al cuadrado ⁽²⁾ con un nivel de significancia de 95%.

Resultados

Según el análisis estadístico de chi cuadrado χ², las técnicas utilizadas para determinar Salmonella spp. en los alimentos mostraron diferencia significativa (p<0,001). En la tabla 1 se muestra la distribución de los aislamientos de Salmonella spp. por tipo de alimento y método de aislamiento utilizado; el método convencional reveló un total de 23/311 positivos para Salmonella spp., mientras que la técnica PCRTR mostró un total de 34/311 casos positivos. Del total de muestras analizadas, sin importar el origen y el tipo de alimento, se obtuvo una frecuencia de Salmonella spp. de 16,1% (50/311), ya que 7 fueron positivas por los dos métodos; con respecto a los casos positivos, la PCR-TR mostró una especificidad de 68%, mientras que para el método convencional, fue de 46%.

Debido a que el tamaño de las muestras de cada alimento no era el mismo para cada uno de ellos, no se logró determinar cuál fue el mejor método utilizado por tipo de alimento. El origen de las muestras con respecto al número de casos positivos, independientemente de la técnica utilizada, mostró diferencias significativas (p<0,001): la planta de beneficio animal, certificada con sistema HACCP, una Salmonella detectada, y las ventas callejeras, 49 microorganismos detectados.

También, el tiempo requerido por cada técnica en la determinación de Salmonella spp. mostró diferencia significativa (p<0,001). La técnica de PCR-TR se tardó en promedio 24 horas, en contraste con el método convencional que tardó entre 4 y 5 días.

Discusión

Esta determinación de Salmonella spp. en carne y productos cárnicos por técnicas de biología molecular, como el PCR-TR, es el primer trabajo de campo realizado en un área como el departamento de Córdoba, que es el principal proveedor de carne bovina en Colombia. La industria de producción de carnes es un sector importante en el país, que representa el 1,8% del PIB generado por el total de la industria manufacturera nacional y el 6,8% de la industria de alimentos. En el 2005, se produjeron en Colombia 1’697.613 toneladas de carne; 48% de este volumen correspondió a carne de res, con cerca de 809.000 toneladas producidas ese año ⁽⁸⁾.

La importancia de generar productos inocuos radica en la posibilidad de comercializarlos con un margen de certeza sobre su procedencia y calidad sanitaria, lo cual se traduce en un grado razonable de confianza de los consumidores hacia los productos que adquieren. Además, se incrementa la probabilidad de acceder exitosamente a mercados cada vez más competitivos y exigentes. La presencia de microorganismos patógenos en alimentos y las enfermedades producidas por los mismos es uno de los problemas esenciales y crecientes en salud pública, debido al incremento en su frecuencia, el surgimiento de nuevas formas de transmisión, la aparición de grupos de población vulnerables y el impacto socioeconómico que ocasionan ⁽⁹⁾.

Al comparar los resultados obtenidos en el trabajo por el método convencional con otros estudios realizados en Colombia y en otros países de América Latina y del Caribe que utilizaron la misma metodología, se encontró que son iguales a los reportados por Durango et al. ⁽³⁾, quienes aislaron Salmonella spp. en 7,4% de las muestras de alimentos del Caribe colombiano. Sin embargo, son más bajos que los de Carrascal et al. ⁽¹⁸⁾ quienes aislaron Salmonella spp. en 2,08% en la misma región y el de Caballero et al. (19) en Cuba quienes aislaron Salmonella spp. en 3,5% de las muestras de alimentos callejeros. En contraste, en México, Bello et al. ⁽²⁰⁾ aislaron Salmonella spp. en 32,44% de las muestras de carnes crudas y Hernández et al. ⁽²¹⁾ aislaron Salmonella spp. en 11% de las muestras de canales bovinas.

Las ventajas de la PCR-TR en la detección e identificación de bacterias causantes de enfermedades trasmitidas por alimentos, radican en la sensibilidad, especificidad y capacidad para procesar grandes cantidades de muestras en poco tiempo ⁽¹²⁾. En ese sentido, este trabajo demostró una alta especificidad y excelente rapidez debido al corto tiempo utilizado para la detección de Salmonella spp., dato importante para la industria de plantas de beneficio animal que podría incursionar en el mercado internacional.

La obtención de los resultados con respecto a la variable del tiempo son similares a los reportados por Alcazar et al. ⁽²²⁾ quienes utilizaron la técnica de PCR para detectar Salmonella spp. en quesos en 28 horas. No obstante, Daum et al. ⁽¹¹⁾ reportaron, por el uso de la misma técnica en sólo 3 horas, la detección de este patógeno directamente a partir de canales de pollo, sin pre-enriquecimiento.

Un caso positivo de Salmonella spp. en 55 canales bovinas (1,8%) provenientes de la planta de beneficio animal, fueron similares a los reportados por Korsak et al. ⁽²³⁾ en Bélgica, quienes no detectaron Salmonella spp. por el método convencional en 240 canales de bovinos. En contraste, Hernández et al. ⁽²¹⁾ reportaron la presencia de Salmonella spp. en 11% por el método convencional en canales bovinas en México.

De acuerdo con la legislación colombiana ⁽⁵⁾, la prevalencia de 1,8% Salmonella spp. en la planta de beneficio animal (dada por un resultado positivo), está dentro de los parámetros permitidos para satisfacer el estándar de desempeño de Salmonella. Esto es muy importante en una empresa, ya que cumplir con los requisitos de estándar de desempeño de reducción de patógenos para Salmonella, es indicativo de que los controles de proceso implementados son adecuados para garantizar la inocuidad de los productos.

Igualmente, estos resultados demuestran que el sistema de aseguramiento de la calidad implementado (HACCP) en la planta de beneficio animal, está funcionando correctamente y que el punto crítico de control evaluado (etapa de refrigeración) está siendo controlado, garantizando con ello la inocuidad de la carne en canal. Sin embargo, la planta de beneficio animal está empeñada en que no existan casos positivos de Salmonella, debido a la necesidad que se tiene de incursionar en mercados internacionales donde se deben tener márgenes de seguridad con resultados por debajo de lo permitido ⁽⁵⁾.

Aunque la técnica de PCR-TR es la más específica y sensible entre las disponibles actualmente ^(6-8,10-14), existen diferencias microecológicas importantes en la industria de plantas de beneficio animal y los alimentos callejeros, como carne molida, papa con carne y carne salada. A pesar de que se realizaron diluciones de estos alimentos con el fin de descartar inhibiciones, resultó mayor la detección de Salmonella spp. por el método convencional que por PCR-TR. Esto pudo deberse a la presencia de sustancias en el alimento que ejercen un efecto inhibitorio sobre la PCR. Entre los muchos compuestos identificados que ejercen un efecto negativo sobre la PCR, se encuentran algunos polisacáridos, grasas, iones metálicos y proteínas ^(22,24). Varios autores han reportado la existencia de tales inhibidores en muestras de alimentos, los cuales pueden actuar a diferentes niveles durante el proceso de extracción y amplificación de los ácidos nucleicos y, eventualmente, conducir a la obtención de falsos negativos; por esto se deben tomar precauciones para impedir o limitar su efecto sobre la reacción, principalmente en el proceso de extracción de ADN ^{(22, 24)}. Este estudio tuvo la limitación de que no evaluó los efectos inhibitorios, debido a que no era su objetivo. Sin embargo, muchos de los alimentos analizados poseían un contenido alto en grasas. Infortunadamente, no se pudo cuantificar esta variable.

El chorizo y el queso fueron los alimentos que presentaron mayor contaminación por Salmonella spp. relacionada posiblemente con su excesiva manipulación y, para el caso del chorizo, con la variedad de ingredientes que se usa en su preparación. Estos hallazgos coinciden con el trabajo de Durango et al. ⁽³⁾, quienes reportaron la presencia de Salmonella spp. en muestras de chorizo y queso en 12,6% y 7,9%, respectivamente; también, coinciden con lo reportado por Torres et al. ⁽²⁵⁾, quienes aislaron esta bacteria en 3,4% de las muestras de embutidos frescos, y por Alcazar et al. ⁽²²⁾, quienes encontraron un 2,5% de quesos contaminados con Salmonella spp.

Los alimentos cárnicos, la carne molida y el cerdo también presentaron un alto grado de contaminación por Salmonella spp., debido al alto grado de manipulación de la carne molida y a las malas condiciones en los sitios de expendio de cerdo y carne molida. Los resultados obtenidos coinciden con los de Bello et al. ⁽²²⁾, quienes reportaron que 13,76% de las muestras de carne de cerdo y 1,83% de las de carne molida de res resultaron contaminadas por Salmonella spp.; esto es igual a los resultados reportados por Durango et al. ⁽³⁾, quienes encontraron esta bacteria en 1,6% de las muestras de carne de cerdo.

Aunque este estudio es regional y está circunscrito a una sola ciudad, los resultados muestran el escaso control higiénico sanitario que se tiene en la cadena de procesamiento (recepción de materia prima, elaboración, almacenamiento y comercialización) de los alimentos de la vía pública de Montería, lo que convierte a estos alimentos en un riesgo para la salud de los consumidores, ya que no hay ninguna tolerancia para Salmonella spp. en alimentos procesados. De la misma manera, estos resultados evidencian la falta de implementación de un programa de aseguramiento de calidad para este tipo de alimentos, los cuales se deben regir a nivel nacional por la Resolución 604 de 1993 ⁽²⁶⁾, por el código de prácticas de higiene para la elaboración y expendio de alimentos en la vía pública en América Latina y el Caribe, CAC/RCP 43-1995, del Codex Alimentarius ⁽²⁷⁾, las cuales indican que la inspección deben ser ejercida por la dirección seccional o local de salud, y por las expedidas tambien en el Decreto 1500 sobre inocuidad ⁽²⁸⁾.

Agradecimientos. A Nelson Alvis por sus valiosos aportes en el análisis de los datos.

Correspondencia: Salim Máttar V., Ph.D., Universidad de Córdoba, Instituto de Investigaciones Biológicas del Trópico, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Montería, Córdoba. Correo: mattarsalim@hotmail.com

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