EVALUATION OF Trichoderma asperellum AS BIOREGULATOR OF Spongospora subterranea f. sp. subterranea.
Liliana María Hoyos Carvajal1; Sonia Jaramillo Villegas2 y Sergio Orduz Peralta3
1 Profesora Auxiliar. Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá. Facultad de Agronomía. Carrera 45 No 26-85, Edificio 500. Bogotá, Colombia. <limhoyosca@unal.edu.co>
2 Profesora Asociada. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Facultad de Ciencias Agropecuarias. A.A. 1779. Medellín, Colombia. <sjaramal@unalmed.edu.co>
3 Profesor Asociado. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Facultad de Ciencias. A.A. 3840. Medellín, Colombia. <sordux@cib.org>
Recibido: Mayo 29 de 2008; Aceptado: Septiembre 10 de 2008.
Palabras claves: Sarna polvosa, papa, biorregulación, Trichoderma asperellum, Spongospora subterranea
Abstract. Powdery scab caused by Spongospora subterranea, is one of the main diseases on potato crops, is a protozoo for which exist limited control strategies because it counts with diverse types of inoculum, resistance structures and alternative hosts. The objective of this work was to test Trichoderma asperellum T-84 and T-109 against S. subterranea under controlled conditions in two experiments, evaluating in plants until nine and twelve week, variables of fresh and dry weight and number of galls produced by the pathogen. Consistently the plants with T. asperellum increased fresh weight (Experiment 1) and dry weight (Experiment 2) and reduced the number of nodules of S. subterranea in potato root, better in single applications than in mixture. This is a preliminary study that suggests T. asperellum could be a potential agent of biological regulation in the future for powdery scab, but it will be require studies of the interaction potato plant/S. subterranea/Trichoderma for its implementation.
Key words: Powdery scab, potato, bioregulation, Trichoderma asperellum, Spongospora subterranea
La sarna polvosa de la papa Spongospora subterranea (Wallroth) Lagerheim f. sp. subterranea Tomphson, es un protozoo que actúa como parásito obligado en cultivos de papa, en los cuales se ha convertido en una de las principales enfermedades limitantes; en Colombia concretamente, se encuentra presente en la mayoría de las zonas paperas de los departamentos de Nariño, Cundinamarca, Antioquia y Boyacá. Este patógeno produce pústulas en el tubérculo que deterioran su calidad, y en raíces y estolones de la planta originan agallas en las cuales se encuentra abundante cantidad de quistosoros, limitando la capacidad de translocación de nutrientes y toma de agua. Los rendimientos de un cultivo pueden disminuir hasta un 80% si el patógeno aparece durante la primera etapa de desarrollo, desde siembra a floración, donde el principal órgano atacado es la raíz, si su infección se realiza en la fase de tuberización (70-90 días), no se afectan los rendimientos sustancialmente ya que su efecto es básicamente en tubérculos, disminuyendo su calidad cosmética (Peña, 2000). Es de anotar que la severidad del ataque, no es homogéneo en los tejidos, particularmente en el sistema radical y depende de factores como el tipo de suelo, condiciones climáticas y clon de papa utilizado (Jaramillo y Botero, 2007). S. subterranea es agente transmisor del potato moptop virus PMTV, que causa necrosis y rajadura del tubérculo y se constituye en un agente predisponente para otras enfermedades en el cultivo tales como Phytophthora infestans y Rhizoctonia solani (Davis et al., 2000).
En su ciclo de vida, este protozoo cuenta con diversos tipos de inóculo como plasmodios, zoosporas primarias y secundarias, estructuras de resistencia, como quistosoros, zoosporas y plasmodios enquistados (Hoyos et al., 2008) y amplios hospederos alternos pertenecientes a diversas familias botánicas como Amarantáceas, Asteráceas, Brassicáceas, Chenopodiáceas, Cyperáceas, Fabáceas, Malváceas, Poáceas, Polygonáceas y Solanáceas que incluyen arvenses asociadas a cultivos y plantas de importancia agronómica (Qu y Christ, 2006); todas estas estrategias, facilitan su multiplicación y permanencia en suelos, y además se favorecen por las prácticas agrícolas de las zonas productoras en el país.
Por tanto, las medidas de control que se hacen ineficaces y el desconocimiento de aspectos biológicos y ecológicos de la enfermedad llevan a la búsqueda de alternativas de control o de manejo tales como sistemas de fertilización, búsqueda de variedades tolerantes y manejo de la microbiota del suelo. Trichoderma es el biocontrolador mas empleado en el mundo (Harman, 2006), trabajos en tomate, otro hospedero de este patógeno, realizados por Nielsen y Larsen (2004) con formulaciones de T. harzianum, Bacillus subtilis y Streptomyces sugieren que los dos primeros microorganismos pueden tener potencial de control sobre S. subterranea, entendida como la reducción de nódulos en raíces de tomate, pero se desconocen otras referencias que hagan alusión al control de Trichoderma sobre S. subterranea teniendo la papa como hospedero. Estudios previos de Trichoderma sobre Phytophthora infestans en papa, patógeno cercano en términos taxonómicos a S. subterranea han demostrado su efectividad (Ghorbani et al., 2005; Stephan et al., 2005), concretamente, aislamientos nativos de suelos colombianos del hongo bioregulador T. asperellum T-84 y T-109 han presentado actividad bajo evaluaciones en sistemas controlados (Hoyos et al., 2001), por tanto se presenta el siguiente estudio como un experimento exploratorio en el manejo de la sarna polvosa, cuyo objetivo consistió en evaluar la actividad de regulación biológica de dos aislamientos de T. asperellum T-84 y T-109 procedentes de suelos colombianos sobre S. subterranea bajo condiciones de invernadero.
MATERIALES Y MÉTODOS
]]> Aislamientos de Trichoderma asperellum. Se utilizaron dos aislamientos de T. asperellum T84 y T109 provenientes de la Colección de Microorganismos de la Unidad de Biotecnología y control biológico de la Corporación para Investigaciones Biológicas, seleccionados en estudios previos como eficientes biocontroladores en experimentos in Vitro en otros patógenos en papa (Hoyos et al., 2001 y Restrepo et al., 2001). Los aislamientos fueron subcultivados en Agar Papa Dextrosa (Difco) a 25 °C y multiplicados según se necesitara.Ensayos de invernadero. Como fuente de inóculo de S. subterranea, para ambos ensayos fue empleado un mismo tipo de suelo procedente de cultivos con alta incidencia del patógeno del Centro Agropecuario Paysandú (Santa Elena, Medellín). El material vegetal se obtuvo de tubérculos de papa de la variedad Diacol Capiro por presentar alta susceptibilidad al patógeno (Jaramillo y Botero, 2007); estos fueron sembrados en 1 kg del suelo infestado y los tratamientos fueron incorporados como se indica en cada experimento (Tabla 1)
Tabla 1. Tratamientos de Trichoderma asperellum aplicados a la semilla de papa para bioregulación de Spongospora subterranea.
Experimento 1. Para este experimento se adicionaron soluciones acuosas de T. asperellum ajustadas a 1x 106 ufc /g suelo (Tabla 1), una mezcla de ambos aislamientos en una proporción de 1 x 103:1 x 103 ufc /g suelo fue aplicada. Como tratamiento convencional se utilizó Tiabendazol® aplicado al tubérculo por inmersión en solución al 0,4% durante 30 min., como control absoluto se emplearon tubérculos sin aplicaciones. Cada tratamiento consistió en 10 potes de plantas, las cuales fueron mantenidas en invernadero bajo condiciones óptimas para el cultivo ( 17 °C y 70-80% HR). En estas plantas se cuantificó la incidencia de S. subterranea en el periodo vegetativo a las 9 semanas, periodo en el cual se presentan síntomas visibles del ataque de S. subterranea contando número de nódulos totales en raíz y midiendo peso seco y fresco de la parte aérea y la raíz.
Experimento 2. Este se efectuó como prueba confirmatoria del primer experimento en diferente época. Se utilizaron semillas de papa variedad Diacol Capiro en potes de 1 kg de suelo de la misma fuente del experimento 1. Para este caso el inóculo de T. asperellum fue incorporado 7 días antes de la siembra en cascarilla de trigo (Tabla 1), a una concentración media de 1x 104 ufc/g suelo en orden de favorecer el establecimiento de los aislamientos de T. asperellum en suelo, aportando una fuente de carbono aprovechable por el hongo como lo es la cascarilla de trigo. En este experimento se utilizaron los mismos testigos que en el Experimento 1 y se mantuvieron en condiciones similares. En este, la incidencia de S. subterranea fue analizada en el periodo de tuberización (12 semanas), con el fin de probar en una etapa fisiológica posterior a la evaluada en el primer experimento, muestreando parámetros similares a los registrados en el Experimento 1.
Los resultados de peso seco y fresco fueron analizados mediante análisis de varianza ANAVA y pruebas de diferencia de medias Tukey con el programa Statistica versión 5,1-1998 (Stat. Soft Inc.) y los datos de número de nódulos de S. subterranea en raíces se analizaron mediante un modelo lineal generalizado (glm).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Variables fisiológicas. ]]> Experimento 1. Los análisis de tejidos realizados demuestraron que hay diferencias estadísticas en peso fresco de la parte aérea y radical para el primer ensayo, pero no así cuando se analizó el peso seco. Los tratamientos conT. asperellum T84 y T109 presentaron diferencias significativas con respecto a ambos controles (absoluto y con fungicida), pero, como se realizaron análisis de peso seco estas diferencias no fueron evidentes.
Experimento 2. Se presentaron diferencias significativas en el peso seco de la parte aérea y radical entre los diferentes tratamientos (Tabla 2). Las raíces de las plantas inoculadas con T. asperellum sola o en mezcla, tuvieron incrementos en peso con respecto al control absoluto y el tratamiento convencional con fungicida, la ganancia en peso seco fue alrededor de 250% con respecto a plantas tratadas con fungicida y de un 36% con respecto al control absolute; esta evaluación se realizó en la semana 12 después de la siembra en la etapa de prefloración del cultivo, donde se requiere una gran cantidad de nutrientes porque se están formando los tubérculos en las raíces, donde las plantas inoculadas con T. asperellum se puede favorecer potencialmente el proceso de tuberización, no obstante es necesario realizar ensayos de campo en rendimientos para corroborar tal hipótesis. Para la variable peso seco aéreo, los análisis estadísticos efectuados demostraron diferencias estadísticas significativas, la prueba de comparación de medias separó los tratamientos en dos grupos, uno conformado por el control absoluto y las plantas a las cuales se les aplicó fungicida (tratamiento convencional), otro conformado por los tratamientos donde se inoculó T. asperellum. El peso seco del follaje y en general estructuras aéreas se incrementó en un 92% con respecto a las plantas inoculadas con el tratamiento convencional y con respecto a las plantas del control absoluto aumentó en un 84,5%. Lo anterior puede deberse a que las raíces vigorosas permitieron una toma mas eficiente de nutrientes y su translocación a partes aéreas de la planta y estas pueden presentar mayor tolerancia a enfermedades foliares (resultado no mostrado). En este caso parece evidente un fenómeno de estimulación de crecimiento que se amplia mas adelante; no obstante, trabajos en otros modelos demuestran que la estimulación de crecimiento es un fenómeno notorio sólo en determinadas etapas fenológicas de un cultivo y por tanto es necesario evaluar las variables involucradas en severidad o incidencia para aclarar los mecanismos de acción de este hongo antagonista sobre un fitopatógeno (Hoitink et al., 2006; Hoyos, 2007).
Tabla 2. Influencia de Trichoderma asperellum en el biocontrol de Spongospora subterranea en papa
Incidencia de Spongospora subterranea Experimentos 1 y 2. La variable número de nódulos de ambos experimentos se analizó mediante un modelo de regresión lineal general en una distribución de Chi-cuadrado, mediante el cual se verificó la diferencia estadística entre tratamientos, todos estos resultaron ser diferentes al control absoluto. En el Experimento 1, se presentaron diferencias estadísticas en el número de nódulos/raíz entre los tratamientos inoculados con T. asperellum y el grupo de aquellas plantas que no recibieron ningún tratamiento y las aplicadas con tratamiento convencional. Los tratamientos con T. asperellum presentaron menor número de nódulos por raíz (Figura 1), alcanzando el mínimo valor las plantas inoculadas con el aislamiento T-109, seguido por aquellas inoculadas con T-84, las plantas inoculadas con la mezcla de ambos aislamientos de T. asperellum mostraron un número mayor de nódulos que en aquellos tratamientos donde se aplicó individualmente cada uno de los aislamientos, indicando esto que la mezcla no presentó un efecto aditivo de control para las condiciones de este experimento y sugieren una competencia intraespecífica de los aislamientos de T. asperellum. Las plantas a las cuales se les aplicó el tratamiento convencional presentaron la mayor incidencia de la enfermedad en sus raíces, entendida como número de nódulos, por lo cual para las condiciones de este experimento el fungicida no cumplió su objetivo de controlar S. subterranea, incluso con mas baja efectividad que la de plantas que no recibieron aplicación de ningún agente de control.
Figura 1. Número de nódulos de Spongospora subterranea en raices de papa inoculadas con Trichoderma asperellum T84 y T-109.
Los resultados del Experimento 2, son similares al primero, en el cual los tratamientos con T. asperellum presentaron un número de nódulos menor, siendo el tratamiento con T-109 el que presentó valores menores, pero en este caso la mezcla de T-84/T-109 presentó valores de reducción de nódulos significativos. El tratamiento con T-84 aplicado de manera individual disminuyó su eficacia, ubicándose en la prueba de comparación de medias en el mismo grupo que el control absoluto. De nuevo las plantas tratadas con fungicida presentaron el número de nódulos mas alto por raíz, indicando que bajo las condiciones experimentales probadas este tratamiento no mostró efectividad alguna en el control de la enfermedad, además si se tiene en cuenta el hecho de que estas plantas también registraron el peso seco mas bajo como se indicó en análisis anteriores, la planta de papa no está siendo favorecida por la aplicación del fungicida.
La enfermedad es variable en su ataque en incidencia y severidad. Al respecto numerosos trabajos demuestran que no existe correlación entre el inóculo y el grado de infección (Jaramillo y Botero, 2007; Van de Graff et al., 2007), de igual forma su control o regulación biológica puede serlo puesto que se ignoran los determinantes de patogénesis/control de este microorganismo, la Figura 1 en la cual se diagrama el número de nódulos no transformados en cada tratamiento muestra este mismo fenómeno, y se grafica sin desviaciones estándar, debido a que la variable tiene rangos de variación muy amplios, no obstante, esta sirve para observar la tendencia en reducción de nódulos en las plantas tratadas con T. asperellum, en el Experimento 1 es menor que en el Experimento 2 (Figura 1), esto posiblemente debido a que el tiempo de exposición de la planta al patógeno fue mayor, presentándose un 250% menos de nódulos de S. subterranea (variable no transformada) que las plantas donde se aplicó el hongo antagónico que en las plantas tratadas con el fungicida utilizado. Podría pensarse que este porcentaje de regulación de Trichoderma sobre un protozoo que es endófito en su ataque a la planta y cuyas estructuras no permanecen fuera de la raíz se deba a un efecto de antibiosis del hongo antagonista en el suelo sobre los propágulos infectivos del fitopatógeno; tampoco puede descartarse un efecto del hongo en las sucesiones microbianas del suelo y la incidencia de la rizosfera de la papa sobre estas, que de alguna forma puedan desfavorecer el ataque de la enfermedad.
Aunque la acción de Trichoderma sobre S. subterranea no cuenta con otra referencia que el trabajo realizado por Nielsen y Larsen (2004) cabe aclarar que las explicaciones al fenómeno de regulación biológica en este caso son preliminares, y no se puede afirmar que sea directamente T. asperellum quien ejerza acción reguladora sobre S. subterranea. Es de tener en cuenta que las sucesiones microbianas y por ende la dinámica del suelo en términos de regulación biológica, está determinado por tres factores principales: la planta como principal proveedor de energía a la rizosfera, el tipo de suelo como sustrato (contenido de materia orgánica, textura, estructura, retención de agua, etc.) y el manejo de este en términos de fertilidad y labores (Cook, 2007; Borneman y Becker, 2007). La supresión de la enfermedad en el suelo, es un fenómeno dependiente de los procesos microbianos que ocurren en microhábitats y biosferas de microorganismos, en el cual el concepto de comunidad microbiana y estabilidad de la misma es determinante (Garbeva et al., 2004).
]]> Los resultados aquí expuestos son una contribución al entendimiento de la bioregulación de S. subterranea con Trichoderma spp., para el cual son bien conocidos los mecanismos, enzimas, toxinas y metabolitos que bloquean los patógenos (Harman, 2006), teniendo en cuenta que cada vez toma más fuerza la idea de que para que la bioregulación suceda, es necesaria la presencia de grupos funcionales con potenciales efectos sobre otros microorganismos y su dinámica o interacciones con los otros allí existentes y por supuesto la planta (Cok, 2007, Hoitik et al., 2006). En este orden de ideas se deben considerar como promisorios los aislamientos de T. asperellum evaluados en invernadero para bioregulación de S. subterranea, pero no se puede afirmar que sea debido a interacciones microorganismo/microorganismo o microorganismo/planta, por lo cual ocurre la disminución del número de nódulos causados sobre la planta; sugiriendo de forma prelimiar, que el aumento de peso de la planta puede ser debido a tres posibles mecanismos: Escape de esta a los propágalos infectivos del protozoo fitopatógeno, también es posible que metabolitos que actuen directamente sobre S. subterranea y una última opción puede ser que el hongo antagonista modifique o actue en las sucesiones particulares del suelo empleado en el experimento y se halle involucrado un tercer tipo de microorganismo o metabolito que tengan acción directa en supresión de la enfermedad, como puede ocurrir en interacciones Trichoderma-planta (Woo et al., 2006). Esto puede explicar la relativa discordancia que existe entre los resultados de las evaluaciones in Vitro, de invernadero y de campo en cuanto a bioregulación (Hoyos et al., 2008) y hace necesario el entendimiento de las interacciones planta-fitopatógeno-bioregulador desde su biología y ecología, que permita valorar su potencial aplicación masiva.
CONCLUSIONES
Consistentemente, las plantas tratadas con T. asperellum T-84 y T109 aumentaron el peso fresco (Experimento 1 a las 9 semanas) y peso seco (Experimento 2 a las 12 semanas) solos o en mezcla.
El número de nódulos de S. subterranea en raíces de papa (severidad) disminuyó por las aplicaciones de T. asperellum T-84 y T109, actuando mejor en aplicaciones solos que en mezcla.
Bajo las condiciones experimentales probadas, las aplicaciones del fungicida al tubérculo presentaron un efecto detrimental en peso, incluso inferior al testigo absoluto y no mostraron efecto en control de S. subterranea.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue patrocinado parcialmente por Colciencias beca 22130712531, Corporación para Investigaciones Biológicas, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín y CEVIPAPA.
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