Extracción y caracterización del almidón de pulpa de plátano

Los plátanos empleados fueron de la variedad Musa ABB, los cuales fueron cortados a las 10 semanas de edad y fueron rechazados por la empresa exportadora en la finca la Ury, del municipio de Turbo, Antioquia. Para la extracción del almidón a partir de ellos, se utilizó el método húmedo propuesto por ^{Mazzeo et al. con algunas modificaciones (Mazzeo et al., 2008)}. Se tomaron 1154 gramos de pulpa de plátano previamente lavados y desinfectados con solución de hipoclorito de sodio al 1 %; los plátanos pelados fueron pesados e inmersos en ácido cítrico (Natupharma) al 3 % y posteriormente rallados; la masa obtenida del rallado de plátano fue depositada en una tela y sumergida en agua destilada para obtener el almidón soluble; dicho procedimiento se repitió hasta que la masa dejó de desprender almidón; finalmente se dejó precipitar la solución obtenida y el precipitado se llevó a estufa para su secado a 40 °C por 24 horas.

Una vez obtenido el almidón fue caracterizado con espectroscopía de infrarrojo por transformadas de Furrier (FTIR), para lo cual se empleó un equipo PerkinElmer Spectrum IR, modelo Spectrum Two, serie 112801, en un rango de barrido entre 4000 y 450 cm-1, en el cual se hicieron medidas de porcentaje de transmitancia.

La determinación de los contenidos de cenizas y de humedad se realizó siguiendo los métodos de la AOAC 923.03 y AOAC 925.10 respectivamente (^{TorresRapelo et al., 2013}), empleando un horno de convección marca BINDER, una balanza analítica PRECISA XB220A y una mufla LAB TECH LEF-105S-2.

Elaboración y evaluación de los recubrimientos

Se desarrollaron 6 recubrimientos variando la concentración de almidón, glicerol y extracto de tomillo. Las concentraciones de cada formulado se presentan en la Tabla 1.

La fabricación de las películas se hizo de acuerdo con el método propuesto por Vázquez et al. (^{Vázquez Luna et al., 2018}). Para ello se prepararon dos soluciones de almidón; una con almidón al 3 % p/v y otra al 4 % p/v en agua destilada, bajo agitación constante / 70 °C/ 30 min y evitando la gelatinización del almidón, posteriormente a cada solución se le adicionó 2 y 3 % (v/v) de glicerol y se continuó la agitación por 15 min; seguidamente se adicionó a cada una de las formulaciones 0.05 % v/v de extracto de tomillo (Phitoter [1 kg/l]) parar lograr una concentración de 500 mg de tomillo/l equivalente a 150 mg timol/l, según la concentración de timol en tomillo reportada por (^{Muñoz-Acevedo et al., 2007}) y se agitó hasta alcanzar temperatura ambiente. Cada formulación se sirvió en moldes de vidrio con capacidad de 15 ml y se llevaron a estufa por 24 h/50 °C.

Las películas fueron analizadas por infrarrojo bajo las mismas condiciones de la etapa de extracción del almidón, con el fin de evaluar las interacciones entre los componentes de las películas, y también se analizaron por microscopía electrónica de barrido SEM para evaluar la morfología de estas, para lo cual se empleó un microscopio electrónico marca JSM- 6490. A cada película obtenida se le midió el espesor empleando un tornillo micrométrico marca KEX con margen de error de 0.01 mm; se realizaron 5 medidas.

La evaluación de la permeabilidad al vapor de agua (WVP) se llevó a cabo siguiendo la norma ASTM E96/E96M-22 (ASTM E96/96-22). Para ello se tomaron cajas Petri de vidrio de 4.9 cm de diámetro aproximadamente, a cada caja se le adicionaron 5 ml de agua destilada y se selló con la película fabricada, fijándola con una banda elástica. Cada sistema fue pesado y llevado a desecador con condiciones de humedad y temperatura estandarizadas.

La humedad relativa (%HR) fue medida con un termohigrómetro modelo Htc-2. Los análisis se hicieron por 5 días, registrando la masa del sistema cada 24 horas. Cada ensayo se realizó por triplicado.

Las pruebas mecánicas de resistencia a la tracción (MPa) y elongación (%E) se realizaron de acuerdo con lo establecido en la norma ASTM D882-10 (ASTM D882-10), empleando probetas de 1.6 cm de ancho por 12 cm de largo, las cuales fueron evaluadas a una velocidad de avance de 5 mm/min y una longitud entre mordazas de 8 cm en maquina universal de doble columna, marca Shimadzu con capacidad de carga de 5 toneladas. El efecto de las concentraciones de glicerol y almidón sobre las propiedades mecánicas, resistencia a la tracción y elongación se estableció mediante el análisis de varianza ANOVA, con un nivel de significancia P≤ 0.05, usando el programa estadístico Statgraphics Centuriun18-X64.

Evaluación de los formulados sobre fruto

El formulado seleccionado se aplicó sobre plátanos cortados a las 10 semanas de edad; para ello, inicialmente se separaron los plátanos del racimo evitando desgarres en la corana, y se lavaron por inmersión en soluciones consecutivas de alumbre e hipoclorito al 2 % por 10 min cada una.

Finalmente, los frutos fueron recubiertos por inmersión de manera individual (cada plátano por separado) en 300 mL de la solución formadora del recubrimiento durante 1 min, se colgaron del pedicelo para evaluar la maduración en el tiempo y se compararon los frutos que tenían recubrimiento y con el no recubierto, que fue usado como patrón.

Evaluación del efecto antifúngico

El poder antimicrobiano de los recubrimientos se evaluó usando los hongos de género Penicillium y Aspergillus, que están relacionados con la maduración prematura en banano y plátano (^{Kumlachew, 2014}). Estas cepas fueron aportadas por el laboratorio de docencia de la sede de Estudios Ecológicos y Agroambientales Tulenapa, de la Universidad de Antioquia. Los hongos fueron sembrados en medio PDA para su crecimiento y posterior utilización. Para esta prueba se utilizaron las formulaciones que presentaron las mejores características en la formación de las membranas y se utilizó la técnica de disco-placa propuesta por Domenico & Dorta con algunas modificaciones. (^{Domenico & Dorta, 2010}).

Caracterización del almidón

En la Figura 1 se muestra el almidón sólido extraído. El método de extracción de almidón por vía húmeda permitió obtener un rendimiento del 45.32 %. Este valor está en el rango de los reportados por otros autores como ^{Mazzeo et al. (2008)}, que obtuvieron rendimientos de 56.76 % en extracción de almidón por método húmedo a partir de plátano dominico hartón (Musa ABB Simmonds), y como Valerio Dávila, que obtuvo un rendimiento de 23.54 % en extracción de almidón de plátano bellaco (Musa Paradisiaca) (Valerio-Dávila, 2014). El rendimiento obtenido demuestra que el proceso de extracción húmedo de almidón a nivel de laboratorio puede considerarse adecuado y, al compararse con otros estudios, sus resultados son similares.

El contenido de cenizas fue de 0.20 ± 0.02; este resultado concuerda con lo reportado por otras investigaciones, aunque es menor al reportado por ^{Lucas et al. (2013)}, quienes obtuvieron porcentajes de 0.61 % en la caracterización de almidón obtenido de plátano guineo AAAea (Musa Sapientum L), y por ^{García et al. (2011)}, quienes obtuvieron 0.27 % de cenizas en almidón nativo de plátano.

Por otro lado, el porcentaje de humedad de almidón de plátano fue de 11.86 %, valor que fue mayor a los reportados por ^{Contreras et al. (2018)}, que obtuvieron 9.28 % de humedad en almidón de plátano cuadrado y a los reportados por ^{Alvis et al. (2008)}, quienes reportaron porcentajes entre 8.66 a 10.22 % para almidón de ñame y entre 7.80 a 8.47 % para almidón de yuca. Se ha sabido que un porcentaje de humedad alto implica complicaciones en la conservación y almacenamiento del almidón, además presenta condiciones idóneas para el crecimiento de hongos, por tanto, es necesario aumentar el tiempo de secado en el proceso para disminuir el contenido de humedad.

En la Figura 2 se presenta el espectro FTIR de almidón extraído del plátano, en ella se observan las bandas características para este tipo de compuesto. En una longitud de onda de 3272.09 cm.1 se observa una banda ancha, la cual se debe a los estiramientos de los enlaces OH- de los grupos hidroxilos presentes en la molécula del almidón; la señal que se observa en 2922.35 cm-1 corresponde a las vibraciones de los enlaces C-H de los grupos metilos. Además, se observa un pico en una banda de 1644.89 cm-1, que corresponde a las vibraciones por flexión del grupo O-H que proviene del agua intramolecular contenida en el almidón. También se observan señales a números de onda de 1078.08, 993.38, 860.76 cm-1, que corresponden o son atribuidos a los estiramientos de los enlaces carboxílicos C-O; estos resultados concuerdan con lo reportado por Torres- Becerril et al. (2015).

Caracterización y evaluación de los recubrimientos

En la Figura 3 se presenta una imagen de un recubrimiento logrado en las diferentes formulaciones.

La Figura 4 muestra los espectros de absorción de los recubrimientos fabricados con el almidón extraído. En ellos se pueden observar las bandas características del almidón, además se observa un pico en una longitud de onda alrededor de los 3200 cm-1 que corresponde a los estiramientos de los enlaces OH- de los grupos hidroxilos; en 2900 cm-1 se observa otro pico que corresponde a las vibraciones de los enlaces C-H de los grupos metilos. También se presentó un pico característico alrededor de 1000 cm- 1, que corresponde a las vibraciones por flexiones de los grupos O-H. Los aumentos de intensidad de los picos observados en los recubrimientos que contenía glicerol, en comparación con los que no contenían, reflejan las interacciones químicas que se presentaron en las formulaciones (^{Zhong y Xia, 2008}).

Según ^{Arrieta-Almario et al. (2018)}, el aumento en la intensidad de las bandas principales indica mayor movilidad de sus moléculas, fenómeno que puede estar relacionado con una mayor flexibilidad en las películas.

En la Figura 5 se presentan las micrografías de los recubrimientos fabricados.

En las micrografías se logra observar la matriz polimérica donde se acoplaron muy bien las moléculas de almidón, y donde no se evidenció presencia de poros o fracturas, resultado que concuerda con lo reportado por ^{Chávez et al. (2012)}. Además, se observan estructuras amorfas blanquecinas de diferentes tamaños entre 1.41 a 47.87 µm; estas estructuras pueden deberse a la presencia de azucares o compuestos de bajo peso molecular que pudieron haber sido desplazados en el recubrimiento por la pérdida de agua en el proceso de secado.

La mayor cantidad de estructuras amorfas se presentó en los recubrimientos con mayor concentración de almidón (R1 y R2), lo que también puede sugerir parte no disueltas de este. Por su parte, el recubrimiento R5, que no contenía glicerol, mostró gran cantidad de partículas, las cuales corresponden a fragmentos no solubilizados de almidón, lo que origina el rompimiento de la película a la hora de su manipulación. En el recubrimiento R3 se observan partículas de 8.79 µm de diámetro aproximadamente, además, presentó una textura más homogénea, lisa y con pocas rugosidades, lo que indica una mejor interacción entre los componentes.

En la Tabla 2 se presenta el espesor promedio de los recubrimientos obtenidos; en ella se observa que los tratamientos que contenían una concentración de almidón de 4 % p/v (R1 y R2) obtuvieron un mayor espesor en comparación con los que contenían un 3 % p/v (R3 y R4), lo que indica que la concentración de almidón tuvo un efecto sobre el espesor de los recubrimientos. Los valores de espesor concuerdan con lo reportado por ^{Vázquez-Luna et al. (2018)}, quienes obtuvieron espesores de 0.04 y 0.05 mm en películas a base de almidón nanoestructurado.

En la Figura 6 se muestra el comportamiento de la pérdida de masa de agua a través del tiempo para las películas evaluadas. De manera general, se puede decir que los recubrimientos se comportaron muy similar entre ellos, y perdieron la totalidad de masa al 4° día de prueba, con una disminución por etapas para las muestras R1, R2 y R4; mientras que la pérdida en la muestra R3 fue gradual, lo que da a entender que el comportamiento de esta formulación es más estable a la pérdida de masa o que tiene un mejor comportamiento a la permeabilidad de vapor de agua.

De esta manera, se puede decir que los recubrimientos son aptos para ser utilizados en la protección de frutas debido a que permiten el intercambio de agua y gas entre esta y el ambiente. El recubrimiento R3 (3 % almidón y 3 % glicerol) mostró un comportamiento más uniforme en la pérdida de masa a través del tiempo en comparación con las otras formulaciones, las cuales presentaron pequeñas fluctuaciones entre los días 3 y 4; este comportamiento se puede atribuir a que los recubrimientos no presentan un espesor uniforme a nivel microscópico y que se pudieron presentar pequeñas fugas de agua en el recipiente de ensayo. La importancia de esta figura radica en que permite determinar el cambio de masa en el tiempo, necesaria para calcular el índice de permeabilidad del recubrimiento y su posterior permeabilidad, reportados en la Figura 7.

Una de las cualidades más importantes en el diseño de recubrimientos es la permeabilidad al vapor de agua, ya que de esto depende que en los frutos se controle la pérdida de agua, y se evite la pérdida de dureza y la ganancia de humedad que puede originar proliferación de microorganismos que afectan la calidad de los frutos. En ese aspecto, el recubrimiento que mejor controló la pérdida de agua fue R2 (4 % almidón y 2 % glicerol), el cual presentó una permeabilidad de 4.7 x 10-3 g*mm/h*Pa*m2 seguido por R3 (3 % almidón y 3 % glicerol) con 5.04 x 10-3 g*mm/h*Pa*m2. La permeabilidad al vapor de agua puede ser afectada por la concentración de glicerol (plastificante), debido a que disminuye la fuerza intermolecular en la matriz polimérica, lo cual otorga una mayor movilidad molecular y aumenta su permeabilidad (^{Joaqui y Villada, 2013}).

En esta investigación se observó un comportamiento similar, pues el recubrimiento R1 que contenía la concentración más alta de glicerol obtuvo un valor de permeabilidad superior frente a los demás. La permeabilidad al vapor de agua puede ser afectada por los componentes de la mezcla, la adherencia al fruto, y el espesor de las películas entre otros. Según Romero et al. (2011), la concentración de almidón y la fuente botánica de la cual se extrae puede afectar esta característica, ellos obtuvieron valores de permeabilidad al vapor de agua de 6.6x10- 6 g/h*Pa*m en películas de almidón modificado de plátano.

En cuanto a las pruebas mecánicas, en la Figura 8 se presentan los porcentajes de elongación obtenidos para cada uno de los recubrimientos evaluados. Mediante la manipulación de los recubrimientos se pudo evidenciar que estos presentaban características de elasticidad y flexibilidad. Durante la evaluación de los porcentajes de elongación todos los recubrimientos presentaron un comportamiento elástico semejante. No obstante, el recubrimiento R2 presentó una elongación de 19.350 %, la cual corresponde al valor más alto en comparación con los recubrimientos evaluados. Se evidenció que los formulados R2 y R4, que contenían una concentración de 2 % de glicerol, formaron los recubrimientos con mayores porcentajes de elongación; este efecto puede atribuirse a que el glicerol mejora las propiedades de elasticidad y flexibilidad en los recubrimientos, no obstante, el incremento en los valores de elongación implica una mayor deformación del recubrimiento debido a que el glicerol disminuye la atracción molecular entre las cadenas poliméricas, lo que incrementa su flexibilidad; este dato concordó con lo reportado por Chang (^{Jun, 2000}). Los resultados obtenidos con estas formulaciones son similares a los presentados por ^{Romero- Bastida et al. (2011)}, quienes obtuvieron porcentajes de elongación de 16.88 ± 1.93 % en películas de almidón de plátano.

Se observó que los valores más altos de resistencia a la tensión fueron los obtenidos con las formulaciones R2 y R4, con valores de 0.389 y 0.681 MPa respectivamente (Figura 9). Los recubrimientos que contenían 2 % de glicerol en su formulación presentaron mayor resistencia a la tensión en comparación con los que contenían 3 %; además se observó que un aumento en la concentración de glicerol produce una disminución en la resistencia a la tensión, es decir, se requiere una fuerza menor para romper el recubrimiento. No obstante, al aumentar la concentración de almidón no se evidenció un aumento en la resistencia a la tensión debido a que los recubrimientos que presentaron mayor resistencia fueron R2 y R4, los cuales contenían una concentración de 3 y 4 % de almidón respectivamente. La elongación no se ve afectada por las concentraciones de almidón y glicerol evaluadas: de acuerdo con el análisis estadístico el almidón presenta un (p=0.8274) y el glicerol un p=0.3451.

Los valores de resistencia a la tensión obtenidos en este análisis son similares a los presentados ^{por Romero-Bastida et al. (2011)}, quienes reportaron valores entre 0.31 ± 0.04 y 3.61 ± 1.31 MPa en películas de almidón de plátano, y por ^{Contreras et al. (2021)}, quienes reportaron que la adición de glicerol sobre una matriz polimérica otorgó elasticidad a películas de almidón, además de otorgar una mayor capacidad de absorción de agua. Sin embargo, se encontró que la adición de glicerol provocó valores menores de resistencia a la tensión, lo que está en concordancia con lo reportado por (^{Contreras Chávez, y otros, 2021}), y por ^{Anchundia et al. (2016)}, que reportaron valores entre 4.43 y 12.28 MPa de resistencia a la tensión en películas a base de cascara de plátano. Las pruebas estadísticas indican que, para los porcentajes evaluados, el almidón no presenta efecto significativo sobre la resistencia a la tensión (p=0.2262), mientras que el glicerol sí ejerce efecto significativo sobre dicha propiedad (p= 0.0140). Las mayores resistencias a la tensión se logran en las concentraciones más bajas de almidón y glicerol, que corresponden con la formulación R4.

En cuanto a la evaluación antifúngica de los recubrimientos evaluados, las Figuras 10 y 11 muestran los resultados obtenidos, tanto para Aspergillus como para Penicillum. Las pruebas antimicrobianas se hicieron con las formulaciones R2 y R3 ya que presentaron mejor característica en la formación de recubrimiento. Cabe aclarar que todas las formulaciones contenían la misma concentración de extracto de tomillo (0.05% v/v). Las figuras presentan los cultivos y el blanco a día cero, y luego de 7 días de cultivo.

Después de 7 días desde el cultivo se observó el crecimiento del hongo Aspergillus en todas las muestras evaluadas, incluyendo el blanco, por tanto, las formulaciones no ejercieron un efecto inhibitorio ni fungistático sobre este hongo, lo que hizo necesario recalcular la concentración del aceite de tomillo en la formulación, dado que durante los últimos años se han reportado los efectos antifúngicos de extractos y aceites esenciales de plantas sobre Aspergillus ( ^{Dikbas et al., 2008}).

En la Figura 11 se puede observar una disminución del crecimiento de Penicillium en cada uno los medios tratados, donde la formulación R3 generó una disminución mayor en comparación con la formulación R2. Estos resultados dejan en evidencia el poder protector del formulado potencializado con el extracto de tomillo sobre Penicillium. En otros estudios en los que se aplicaron directamente los extractos de tomillo se alcanzaron inhibiciones en los crecimientos microbianos, sobre otras especies de hongos. ^{Taborda-Andrade et al. (2015)} reportaron 100 % de inhibición del moho gris Botrytis Cinerea sobre fresas usando 125 mg timol/l. En estudios sobre tomate árbol se reportó inhibición en la germinación de esporas de Colletotrichum acutatum cuando se usó aceite esencial de tomillo directamente (^{Alzate et al., 2009}).

La aplicación de extracto de tomillo sobre el fruto en laboratorio generó una disminución en el porcentaje de pérdida de peso, como se puede observar en la Tabla 3. Los plátanos que fueron recubiertos presentaron un porcentaje de pérdida de peso de 13.24 ± 2.72, valor inferior al de los controles (19.12 ± 4.30), lo que indica que el recubrimiento fue eficiente en controlar la pérdida de agua y compuestos volátiles que generan la maduración del plátano. Estos resultdos concuerdan con lo reportado por ^{Baldwin et al. (1966)}, quienes afirman que los recubrimientos previenen la pérdida de peso debido a que crean una barrera semipermeable al oxígeno, al dióxido de carbono, a la humedad y al movimiento de solutos, y generan reducción en la tasa de respiración.

En la Figura 12 se presentan los frutos sin y con recubrimiento: en ella se puede observar que los frutos recubiertos con el formulado R3 no presentaron cambio en la coloración después de haber transcurrido 8 días de prueba, en cambio, los frutos que no fueron recubiertos presentaron cambio de coloración a partir del día 6, y al cabo del día 8 ya se encontraban completamente amarillos, color que indica que habían alcanzado un grado de madurez 6 según la escala de maduración de 1 a 7 de Von Loesecke propuesta por ^{Soto (2008)} (Figura 13). Adicionalmente, los plátanos recubiertos presentaron una apariencia más brillante, lo que les da un mejor aspecto a los frutos. Igualmente, se evidenció cualitativamente que el recubrimiento retrasó el proceso de maduración de los plátanos hasta el día 3 en la escala de maduración reportada por Soto (2008), posiblemente por la limitación en la producción de etileno.

En cuanto a las pruebas de campo, los frutos recubiertos presentaron características similares a las observadas en las pruebas de laboratorio, como se observa en la Figura 14. Al transcurrir 8 días de prueba no se evidenció maduración en los plátanos recubiertos, tampoco se observó crecimiento de microrganismos que afectan los frutos y conservaron el brillo presentado en el día de la impregnación. Los plátanos que no fueron recubiertos presentaron maduración y amarillamiento de la cáscara, además presentaron una apariencia más desgastada. Estos resultados permitieron evidenciar que la aplicación de los recubrimientos sobre los frutos, cortados a las 10 semanas bajo las condiciones experimentales, tiene un efecto positivo en retardar la maduración por al menos 2 días en plátanos expuestos al ambiente. Lo encontrado concuerda con lo reportado por diferentes autores que lograron alargar la vida útil de los frutos conservando la calidad de estos a través de recubrimientos a base de almidón, como es el caso de ^{Amaiz et al. (2016)}, quienes emplearon 7 % de almidón, o como ^{García y Pinzón (2018)}, que usaron 4 % de almidón de plátano.