ARTÍCULOS ORIGINALES DERIVADOS DE INVESTIGACIÓN

EFECTO DEL ALMACENAMIENTO EN SOLUCIÓN DE HBSS SOBRE LA DIFUSIÓN TRANSDENTINARIA EN TERCEROS MOLARES EXTRAÍDOS¹

¹ Estudio adscrito a PRI-ODO 0304/2012 UCHILE. Este estudio fue parcialmente financiado por un Fondo de Colgate-Palmolive-Chile, los autores expresan no tener ningún conflicto de intereses

² Cirujano Dentista, Universidad de Chile

³ Profesora asistente, Departamento Odontología Restauradora, Universidad de Chile

⁴ Profesor titular, Departamento Odontología Restauradora, Universidad de Chile

⁵ Instructores, Departamento Odontología Restauradora, Universidad de Chile

⁶ Profesor, Departamento de Odontologia Restauradora, Disciplina de Dentística, Universidad Estadual Paulista, São Paulo, Brasil

⁷ Profesor Asistente, Departamento Odontología Restauradora, Universidad de Chile. Correo electrónico: edofdez@yahoo.com

RECIBIDO: MARZO 5/2012-ACEPTADO: OCTUBRE 15/2013

Araya F, Sommariva C, Moncada G, Cartagena A, Letelier C, Oliveira O Jr et al. Efecto del almacenamiento en solución de HBSS sobre la difusión transdentinaria en terceros molares extraídos. Rev Fac Odontol Univ Antioq 2013; 25(1): 158-175.

RESUMEN

Palabras clave: dentina, conductancia, difusión.

INTRODUCCIÓN

La dentina forma la estructura central de los dientes. Su espesor está atravesado por túbulos que se extienden desde la pulpa hasta el límite amelodentinario. Estos túbulos le confieren la característica física de permeabilidad.¹

La primera descripción de permeabilidad de sustancias a través de la dentina fue dada por Fritsch, en 1914. En la década de los 40, Lefkowits observó cómo un colorante inyectado en la pulpa de un diente, penetró en toda la dentina en un poco más de media hora. Algunos años después, Bodecker y Lefkowitz observaron cómo el colorante de un material de obturación, puesto en una cavidad profunda, fue capaz de pasar a zonas adyacentes del esmalte, dentina y pulpa. Se define conductancia hidráulica de la dentina como la habilidad del fluido de pasar a través de esta,² y el término permeabilidad dentinaria involucra el pasaje de fluidos, iones, moléculas, partículas y bacterias en y a través de la dentina, bajo diferentes condiciones.^{1, 3}

Pashley y colaboradores han estudiado la relación de la permeabilidad de la dentina con su topografía, morfología y con distintas soluciones.^{1, 3-14} También se ha investigado la permeabilidad de diversos componentes de los materiales dentales, y su posible efecto citotóxico en las células pulpares.^15-20 Otra línea de investigación que nace de la permeabilidad dentinaria, es la prueba de sistemas adhesivos.¹⁵ Producto de la hidratación y naturaleza compleja de este tejido, la adhesión a la dentina y el sellado de las superficies dentinarias expuestas, continúa siendo una problemática a pesar de los avances en la odontología adhesiva. Modelos de permeabilidad han sido usados para calcular la capacidad de los sistemas adhesivos para sellar la dentina y para determinar la fuerza de adhesión a ella de distintos sistemas adhesivos, cementos y otros materiales dentales.

A pesar de ser un campo con mucha investigación a la fecha, existe muy poca información acerca de la permeabilidad de la dentina en distintos estados de maduración o de variables sistémicas que pudieran afectar la maduración o composición de ella y su permeabilidad.

La información existente, acerca de cómo funcionan los modelos experimentales para estudiar la permeabilidad de la dentina in vitro, es poca.

Dentro de las distintas variables que existen en los estudios in vitro de permeabilidad dentinaria, la solución en la que se almacenan los discos de dentina mientras son estudiados ha determinado ser vital para reproducir condiciones posibles de encontrar in vivo, y que finalmente resulta crítica en la evaluación de cualquier estudio relativo a la conductancia hidráulica. Es así, ya que la solución en la que se encuentren las muestras determinará la manera en que se mantendrán las propiedades del disco, pudiendo influenciar notoriamente su grado de permeabilidad.²¹ Por este motivo,²² el presente estudio tiene la finalidad de analizar diferentes soluciones de almacenamiento, entregando como nueva alternativa la Solución de Hank (Hank'S Balanced Salt Solution, HBSS)²²

Esta solución actualmente posee uso reconocido en traumatismos dentales, dado que le otorga una mayor viabilidad a las células periodontales en casos de avulsión. Además, posee un pH, osmolaridad y componentes iónicos que la hacen un material ideal para el almacenamiento de tejidos dentales.^{21, 23-27} De esta manera, resultará necesario comprobar si esta sustancia mantiene en condiciones óptimas a los discos para medir su conductancia hidráulica, pudiendo convertirse en alternativa para futuras investigaciones. El suero ha sido constatado como un medio de almacenamiento inadecuado, debido a los grandes cambios estructurales producidos en dentina, y que se traducen en un aumento excesivo de permeabilidad.²⁸ De hecho, la dureza y el módulo de elasticidad de Young disminuyen cuando las muestras son almacenadas en suero, presumiblemente debido a la pérdida de calcio superficial que permite la exposición de colágeno dentinario, lo cual puede tener un efecto en la hidrólisis de las fibras de colágeno expuestas.

En el campo de la endodoncia, han utilizado diferentes soluciones con características fisiológicas, en especial para problemas derivados del traumatismo dentoalveolar, como lo es la avulsión dentaria. La avulsión dentaria es una de las formas de trauma dental más severas, siendo descrita como el desplazamiento completo del diente desde el alvéolo.

Dado lo complejo de la situación, el paquete vasculonervioso resulta altamente comprometido, hecho que genera muchas veces la pérdida de la vitalidad pulpar.²⁹ Por esta razón, los endodoncistas han buscado por años soluciones capaces de mantener al diente estable luego de una avulsión, para su posterior reimplantación.

En esta búsqueda es donde apareció la Solución de Hank o HBSS (Hank's Balanced Salt Solution). Esta solución es levemente básica, teniendo un pH entre 7,2 y 8,0. Es altamente concentrado en iones Ca2+, Mg2+, Na+, PO34 y Cl+, y tiene una composición comparable con las fases minerales dentales.²¹ Además, posee un bajo potencial químico de disolver las fases del calcio fosfato en el diente, por lo que la superficie de desmineralización es prevenida.²³Igualmente, la osmolaridad de la solución de Hank es de aproximadamente 300 mOm/l,^{24, 25} y dado que la osmolaridad ideal para la preservación de células se encuentra entre los 230 y los 400 mOm/l, la transforman en una solución ideal para este tipo de tareas.^{26, 27} De hecho, son múltiples los estudios que comprueban la efectividad del HBSS como medio de conservación de células del ligamento periodontal en casos de traumatismo, entre ellos Ashkenazi, quien mostró que la solución de HBSS es el medio de almacenamiento más efectivo para la preservación de la viabilidad, motilidad y capacidad clonogénica de las células del ligamento periodontal, después de ser almacenadas por 24 horas a 22°C.³⁰

Dada las características conservadoras de tejido que proporciona la solución de Hank, comenzó a ser estudiado en profundidad, además de aumentar su aplicación práctica. Resultó ser, por ejemplo, un excelente medio de conservación de dentina y esmalte para estudios a corto plazo de resistencia mecánica del diente. ²³ Sin embargo, no es menor el hecho de precisar que la solución de Hank resulta ser más cara que otras soluciones, además de ser inestable cuando se expone a la luz por cortos períodos de tiempo,²⁴ razón por la que el estudio de sus características, beneficios y contraindicaciones está aún en progreso. El propósito del estudio es determinar in vitro la variación en la tasa de filtración transdentinaria (conductancia hidráulica) en discos de dentina humana, luego de 2, 4, 6, 7, 14, 21 y 28 días almacenados en solución de HBSS, en formalina al 10% y en suero fisiológico.

MÉTODOS

En este estudio de tipo observacional, se utilizaron 41 terceros molares humanos sanos en inoclusión, extraídos de personas entre 16 y 30 años, cuyo diámetro coronal no fue mayor de 12mm, obtenidos previa firma de un consentimiento informado por parte del paciente, el cual fue aprobado por el comité de ética de la Facultad de Odontología de la Universidad de Chile. Posterior a la extracción, se limpiaron manualmente con Cureta 13-14 Gracey (Hu- Friedy-USA), luego fueron desinfectados durante 24 horas en una solución de Timol al 0,1% (SIGMA, England), y finalmente fueron dejados en una solución de HBSS, a temperatura ambiente, y por dos semanas o menos.

Luego, los especímenes en estudio fueron incluidos en bloques de resina epóxica Bosh, de 25 mm de tamaño. Para esto, los molares fueron limpiados con agua destilada, se les aplicó ácido ortofosfórico (Coltene-Whaledent) al 37%, por 30 segundos. Fueron lavados, secados y pincelados con cianocrilato. Los dientes después fueron fijados en el interior de un molde cilindrico de silicona envaselinada, de 25mm de diámetro, usando cera rosada en su cara oclusal para fijarlos. Finalmente, la resina epóxica fue vertida en el molde, esperando su polimerización, al menos 48 horas.

Una vez polimerizada la resina epóxica, se hicieron cortes de manera perpendicular al eje mayor del diente, a la altura de la corona, logrando de esta manera discos de 1 mm de grosor. Estos cortes se hicieron con la recortadora ISOMET BUEHLER LER LAKEBUFF IL, USA 1000, a 700 rpm, con 500 gr de presión, bajo abundante refrigeración. Obtenidos los discos, las caras oclusales y pulpares se regularizaron con papel abrasivo (N.° 600 Silicon carbide) bajo agua circulando para estandarizar los espesores y lograr un alisado superficial. Se procedió luego al grabado ácido de cada superficie para eliminar el barro dentinario, por medio de ácido ortofosfórico al 37% por 15 s en cada superficie, y luego lavado profuso con agua.

La recortadora fue utilizada a 700 rpm, con 500 gr de presión en su brazo de corte y bajo abundante refrigeración de agua. El modelo experimental utilizado para medir el flujo, es una modificación al dispuesto por el equipo de Pashley.31, 32 El modelo experimental utilizado para medir el flujo se confeccionó con un reservorio de agua destilada, en una columna vertical de agua de 200 mm, conectada a una llave de paso. Luego, por medio de un tubo de silicona, se conectó a un tubo capilar milimetrado en posición horizontal, al cual se le incorporó una gota de aire. El capilar se conectó distalmente a una cámara en donde se fijaron los discos en estudio (discos de dentina sellados por medio de anillos de silicona) a través de un tubo de silicona (figura 1) .

Modificada a la utilizada por Pashley, cuenta con una columna vertical con 200 mm de agua, conectada por medio de una goma a un capilar, que a su vez se conecta a la cámara donde está el disco dentinario.

El tiempo durante el cual se dispuso cada disco del estudio, fue de 20 minutos, repitiéndose cada medición 3 veces al día, a fin de lograr un promedio diario. De esta manera, además, cada disco fue medido el día en que fue cortado, y a los días 2, 4, 6, 7, 14, 21 y 28 posterior al corte.

De esta manera, y dado los objetivos del estudio, se conformaron 5 grupos experimentales, que fueron los siguientes: Discos almacenados en Solución de Hank (SIGMA, England) (n: 15) , Discos almacenados en formalina al 10% (n: 18), Discos almacenados en suero(n: 5), Medición sin disco (control negativo), Disco de Resina Epóxica (control positivo).

La tasa de flujo de permeabilidad fue medida registrando la posición inicial de la burbuja de aire dentro del capilar, para consignar su posición final después de que transcurrieran 20 minutos (figura 2).

Se mide la variación que tuvo la burbuja de aire dentro del capilar en 20 minutos, con lo que se puede saber la cantidad de agua que traspasó la dentina.

Las mediciones del área de dentina expuesta por disco, fueron calculadas por el software computacional ImageJ³³ (figura 3). Una vez obtenida el área y la tasa de flujo de cada disco, se procedió a calcular la conductancia hidráulica mediante la siguiente fórmula: la conductancia hidráulica corresponde a una fórmula que determina la permeabilidad, en este caso, de los discos de dentina. La variable F corresponde a la tasa de flujo de cada grupo experimental; la variable A corresponde al área de dentina expuesta al fluido; la variable P corresponde a la presión intrapulpar, cuyo valor corresponde a la altura de la columna de agua destilada (200 mm); y la variable t es el tiempo en minutos.

Una vez obtenida la imagen del disco de dentina, con el software Image J se selecciona el área requerida y se obtienen los valores solicitados.

Análisis estadístico: se hizo por medio de la prueba de ANOVA de dos variables y post hoc de Tuckey (SPSSv15). Todo este análisis fue hecho en el software G*Power 3.1, y para la muestra se determinó un valor p = 0,05, un poder estadístico de 0,8 y un tamaño de efecto de 0,5.

RESULTADOS

De un total de 41 terceros molares recolectados en perfectas condiciones para el estudio, se obtuvieron 41 discos de dentina de 1 mm (± 0,01 mm), divididos en 3 grupos, correspondientes a las 3 soluciones de almacenamiento analizadas en este estudio. Los grupos fueron:

La tabla 1 corresponde a las medias con sus respectivas desviaciones tipo, de las diferentes permeabilidades obtenidas en los diferentes medios de almacenamiento. Cabe recordar que los n de cada solución eran diferentes, ya que en la Formalina al 10% el n era de 18 muestras, en Solución de Hank el n era de 15 muestras, y en suero fisiológico el n era de 8 muestras. La figura 4, en tanto, corresponde a la comparación de las medias diarias de los 3 grupos en estudio.

No hay diferencia entre los grupos en los días 0 (p = 0,101), 1 (p = 0,614), 4 (p = 0,155), 6 (p = 0,67) ni 28 (p = 0,621). Sin embargo, sí existe diferencia entre los grupos los días 2 (p = 0,020), 7 (p = 0,017), 14 (p = 0,043) y 21 (p = 0,024) (tabla 2).

Para determinar entre qué grupos hay diferencia significativa, se hace el test post hoc de Tukey (figuras 5, 6 y 7).

En los resultados, podemos apreciar que existe diferencia significativa (p < 0,05) entre las muestras de formalina y suero para el día 2 (p = 0,014), para el día 7 (p = 0,018) y también entre las muestras de formalina y solución de Hank para el día 14 (p = 0,038). Asimismo, se hizo el test post hoc de Tukey en cada solución para determinar entre qué días hubo diferencias significativas.

Dado los resultados, es posible observar diferencias significativas (p < 0,05) en las muestras almacenadas en formalina entre los días 0 y 28 (p = 0,027), y para las muestras almacenadas en suero fisiológico, entre los días 0 y 6 (p = 0,045) y 0 y 7 (p = 0,007).

DISCUSIÓN

Este estudio se origina por la necesidad de contar con materiales que permitan desarrollar estudios, tanto a corto como a largo plazo, en permeabilidad dentinaria, sin que se altere el medio por reacciones entre los tejidos dentarios, los materiales utilizados y la solución de almacenamiento. Las actuales alternativas probadas, no han demostrado tener todas estas condiciones, ya que, por una parte, las soluciones salinas y otras soluciones similares no han podido demostrar su utilidad como medios de almacenamiento a mediano plazo, y otras, como la formalina, si bien han demostrado mejores resultados como soluciones almacenadoras, alteran características propias de los tejidos que finalmente terminan por afectar los resultados obtenidos.^{21, 25, 29}

El modelo utilizado para este estudio, está basado en el modelo utilizado por el grupo de investigación a cargo del grupo de Pashley³¹ y posteriormente utilizado por otros investigadores. Este modelo otorga una herramienta simple y confiable, como lo es la cámara de difusión, para medir la conductancia hidráulica de discos de dentina de manera visual, lo que nos permite tener un reflejo de la permeabilidad dentinaria. El diseño de este estudio varía básicamente en la presión hidrostática utilizada, correspondiente a 20 cm de H₂O a 20°C. Dentro de la técnica utilizada, cabe comparar con Sekimoto, el cual utilizó el mismo modelo pero con una presión de 15 psi de N2 sobre una solución salina fosfatada al 0,2%, equivalente a 1054,8 cm de H₂O a 4°C.34 En muchas investigaciones tienden a aumentar significativamente la presión, debido a lo lento que es el proceso en sí, a fin de obtener medidas mayores. En este caso, y debido a futuros usos del estudio mismo, se decidió utilizar una presión cercana a la fisiológica pulpar, presión que para muchos autores ronda entre los 12 y 18 cm H₂O.³⁵

El hecho de que el flujo dentinario tienda a ir de pulpar hacia afuera del diente, está dado por la diferencia entre la presión ambiental y la pulpar, por lo que ésta última, al ser mayor, genera un flujo expulsivo de fluidos desde la pulpa.¹² Sin embargo, el presente estudio fue hecho generando un flujo desde oclusal hacia pulpar, teniendo en cuenta los resultados de Pashley, quien señaló que el flujo tiende a disminuirse en dirección pulpar-oclusal, debido al mayor riesgo de obliteración de los túbulos por productos pulpares. Pese a esto, la variación encontrada por este autor entre ambos sentidos de flujo no fue estadísticamente significativa.³⁶

En este estudio, se utilizó ácido ortofosfórico para tratar la dentina superficial, dado que este tiende a permear las superficies obliteradas, aumentando la permeabilidad en rangos que van desde 87 a 146%.³⁷ Asimismo, se intentó hacer el tratamiento de ácido bajo condiciones y tiempos similares a las usadas en el trabajo clínico, además de desechar la idea de usar otro tipo de grabadores ácidos de poca aplicación clínica, como lo es el ácido cítrico.

Bajo el mismo parámetro, se utilizó agua destilada, en vez de suero, para medir la tasa de permeabilidad, a fin de evitar cualquier precipitación de sales que pudiesen obliterar los túbulos dentinarios.^{1, 28, 38}

El motivo de utilizar la solución de Hank en este estudio, es el de introducir en estudios de permeabilidad dentinaria una solución que ha demostrado mantener tejidos dentinarios en el tiempo, conservando gran parte de sus características mecánicas, químicas e incluso fisiológicas. Todo lo anterior es en gran parte debido a sus similitudes, tanto en pH como en osmolaridad, aparte de poseer iones similares a las de las fases minerales del diente.

Obtenidos los resultados de este estudio, es posible inferir algunos hechos. Una vez que las muestras comenzaron a ser analizadas, esto es, que fueron puestas en solución de almacenamiento y se midió su permeabilidad en el tiempo, la conductancia hidráulica de las mismas aumentó conforme al paso de los días, situación similar a lo recopilado bibliográficamente. Igualmente, y teniendo en cuenta la figura 4, el grupo que presentó un aumento comparativamente mayor al resto, en especial en los primeros días de estudio, fue el de las muestras almacenadas en suero fisiológico. La contrapartida a esta situación fueron las muestras almacenadas en formalina al 10%, las cuales, si bien tuvieron un incremento de su permeabilidad con respecto al tiempo, fueron las muestras que presentaron menor variación en comparación a su condición basal. Para Goodis y colaboradores,28 esto muy probablemente se debe a la propiedad fijadora de la formalina, hecho que conservaría estructuralmente los túbulos dentinarios, determinando un cambio menor de la conductancia hidráulica.

En los resultados, podemos ver que existe diferencia significativa (p < 0,05) entre las muestras de formalina y suero para el día 2 (p = 0,014) y para el día 7 (p = 0,018), y también entre las muestras de formalina y solución de Hank para el día (p = 0,038). Esto se suma al análisis del test post hoc de Tukey en cada solución, donde se aprecian diferencias significativas en las muestras almacenadas en formalina entre los días 0 y 28 (p = 0,027), y para las muestras almacenadas en suero fisiológico entre los días 0 y 6 (p = 0,045) y 0 y 7 (p = 0,007).

Podemos concluir que los medios estudiados entre sí, poseen diferencias significativas en algunos tramos de análisis, no pudiendo hacerse homologable, al menos en lo que a conductancia hidráulica se refiere, el hecho de almacenar muestras en cualquier solución de almacenamiento. Por otra parte, las variaciones en las muestras, tanto en suero fisiológico como en formalina al 10%, mostraron algunos tramos en que presentaron diferencias significativas, hecho que concuerda con la literatura, respecto a lo difícil que resulta predecir el comportamiento de la permeabilidad dentinaria, incluso en soluciones estimadas como buenas preservantes, como la formalina. Con respecto a la Solución de Hank, no existe diferencia significativa entre los diferentes días de estudio de las muestras, comprobándose por tanto la hipótesis nula de este estudio.

Sin embargo, se sugiere hacer estudios sobre la permeabilidad dentinaria y el comportamiento de la solución de Hank, como medio de almacenamiento, en estudios aún más prolongados en el tiempo que el actual. Se recomienda también, previo a analizar cualquier material en esta solución, comprobar cualquier tipo de reacción del material con la solución de Hank.

CONCLUSIONES

• Hay diferencia estadísticamente significativa en los distintos tipos de almacenamiento de muestras dentarias, para 4 de los 9 días en que se estudió la conductancia hidráulica de las muestras (días 2, 7, 14 y 21).
• Las muestras almacenadas en formalina al 10%, fueron las que mostraron mayores variaciones de su conductancia hidráulica durante el estudio.
• Las muestras almacenadas en Solución de Hank, no mostraron diferencia significativa en su conductancia hidráulica entre los días de estudio.
• La cámara de difusión utilizada en el trabajo, derivada del modelo de Pashley, es un instrumento simple y confiable para el estudio de la difusión en dentina.

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