Establecimiento in vitro

Se obtuvieron plantas madre de brotes cultivados en el campo de los cultivares Martinera y Criolla 1 del Campo Experimental de la Universidad de Córdoba. Los brotes aislados se lavaron con agua de grifo para eliminar la suciedad y se transfirieron a macetas de plástico (48,5cm × 60,0cm) con una mezcla de sustrato de turba y arena (1:1). Las plantas se mantuvieron en un umbráculo con 50% de luz y riego por aspersión dos veces al día (2min cada uno). Se roció un tratamiento alternativo semanal con Mancozeb (4g/L) y Benzimidazol (6g/L) para prevenir ataques de hongos. Se aislaron los brotes axilares o basales que emergieron de los brotes plantados y se usaron como fuente de explante para el establecimiento in vitro. Las hojas y el material de vástago se retiraron de las secciones del tallo (1cm de diámetro) y se seccionaron a los 3cm de largo con una sola yema axilar en cada sección. Las porciones se lavaron durante una hora con agua corriente y luego se desinfectaron en la superficie con una solución de hipoclorito de sodio (1,25% de cloro activo) y dos gotas de Tween 20® durante 20 minutos mientras se agitaban de forma continua.

Posteriormente, las secciones de la planta se lavaron con tres cambios de agua estéril dentro de una campana de flujo laminar. Para evitar la descomposición del explante in vitro, los tejidos blanqueados de la parte final de las secciones del explante se retiraron con un bisturí estéril antes del establecimiento in vitro. Los explantes, que constan de secciones de tallo de 1-2cm de largo con una sola yema axilar, se establecieron en matraces de 250cm3 que contenían 30mL del medio semisólido MS (Murashige & Skoog, 1962) con sales principales, mioinositol (100mg/L), sacarosa (30.000mg/L), HCl de tiamina (0,4mg/L) y Phytagel® (4.000mg/L) (Sigma Co.). Los matraces se cubrieron con dos capas de papel de aluminio resistente y se sellaron con Nescofilm®. Los cultivos se mantuvieron a 20ºC, en un fotoperiodo de 12 horas (40µmol m2 s-2), y se transfirieron cada mes a un medio nuevo de la misma formulación. Después de tres subcultivos consecutivos, se registró el número de explantes vivos, explantes con brotes recién formados, explantes contaminados y medios fenolizados.

Los explantes del cultivar Criolla, en cambio, se obtuvieron de plantas establecidas in vitro que se mantuvieron en condiciones similares, como se describe para Martinera y Criolla 1, durante un año con transferencias mensuales a un medio fresco. Las plantas originales de Criolla se obtuvieron de ensayos sembrados en el Campo Experimental de la Universidad de Córdoba.

Multiplicación de brotes

A fin de determinar las mejores condiciones para la multiplicación de brotes a partir de meristemas axilares, grupos compuestos por tres brotes aislados de los cultivares Criolla, Criolla 1 y Martinera establecidos in vitro se transfirieron a matraces de borosilicato de 200cm3, los cuales contenían 30mL del medio MS semisólido con sales principales, y se complementaron con mioinositol (100mg/L), sacarosa (30.000mg/L), HCl de tiamina (0,4mg/L) y agar (8.000mg/L) (Sigma Co.). Los medios se suministraron de forma independiente a cinco concentraciones de bencilaminopurina (BAP) (0,0mg/L, 0,5mg/L, 1,0mg/L, 1,5mg/L y 2,0mg/L). Los cultivos se cubrieron, se sellaron y se almacenaron como se indica para la etapa de establecimiento.

El experimento consistió en un diseño bifactorial (3 cultivares × 5 niveles de BAP) con 15 tratamientos y cinco repeticiones; se distribuyeron 75 unidades experimentales (recipientes) con un diseño completamente al azar. Cada 20 días se adicionaron a los cultivos 5mL de medio líquido fresco de la misma formulación —según el tratamiento respectivo— y se almacenaron como se indica en la etapa de establecimiento. Después de agregar el medio por cuarta vez (120 días en cultivo), se registró el número de brotes nuevos por explante y la longitud promedio de los brotes (en cm desde la base hasta la punta de la hoja de los diez brotes de cada tratamiento). Los datos se analizaron mediante un ANOVA basado en el modelo de la ecuación 1, donde μ fue la media general, Ƭi fue el efecto del cultivar, β_jfue el efecto del nivel de BAP y Ɛiik fue el error experimental. Las medias se separaron mediante la prueba de Tukey (α = 0,05).

Ecuación 1

Enraizamiento in vitro

Para evaluar las condiciones de enraizamiento, los brotes proliferados (racimos de tres brotes) de los cultivares Criolla, Criolla 1 y Martinera se transfirieron a matraces de borosilicato de 200cm3 que contenían 30mL de un medio MS semisólido con sales principales y mioinositol (100mg/L), sacarosa (30.000mg/L), HCl de tiamina (0,4mg/L) y agar (8.000mg/L) (Sigma Co.). Esto se complementó de forma independiente con cinco concentraciones de NAA (0,0mg/L, 0,5mg/L, 1,0mg/L, 1,5mg/L y 2,0mg/L). Las condiciones de luz, temperatura y fotoperiodo de los cultivos fueron similares, según lo indicado para las etapas de establecimiento y multiplicación. Después de cuatro semanas, se registró el número de cultivos con raíces, el número de raíces por cultivo y la longitud promedio de raíces por cultivo. Los datos recolectados se analizaron con un ANOVA basado en la ecuación 2, donde μ fue la media general, Ƭi fue el efecto del cultivar, βj fue el efecto del nivel de NAA y Ɛiik fue el error experimental. Las medias se separaron mediante la prueba de Tukey (α = 0,05).

Ecuación 2

Aclimatación

Las plantas enraizadas in vitro y los brotes sin raíz de la etapa de multiplicación de cada cultivo se transfirieron a condiciones ex vitro para evaluar la tasa de supervivencia de la planta. Las plantas micropropagadas se extrajeron de los matraces, se lavaron con agua destilada para eliminar el medio y se colocaron en una bandeja de 72 tapones llena de turba (Pindstrup®) como sustrato. Se colocó una sola planta en cada tapón, se roció con agua destilada y se cubrió la bandeja con una cubierta de plástico transparente. Las bandejas se colocaron en un umbráculo (50% de luz) y se regaron cada cuatro horas mediante riego vaporizado. Después de tres días, se quitaron las cubiertas y la frecuencia de riego se cambió a una cada ocho horas. Después de 40 días, se registró el número de plantas que sobrevivieron.

Establecimiento in vitro

La supervivencia del explante en condiciones in vitro se vio afectada por la contaminación microbiana, la baja adaptación y la concentración del agente desinfectante. De 120 explantes de cada cultivar establecidos, solo cinco (4,1%) de Criolla 1 y siete (5,8%) de Martinera sobrevivieron a condiciones in vitro, lo que demuestra el crecimiento de brotes del meristemo axilar. Estos explantes se seleccionaron para trabajos posteriores (tabla 1, figura 1a). Durante las dos primeras semanas, los explantes seleccionados mostraron fugas fenólicas, ennegrecimiento del tejido y descomposición, lo que obligó a transferirlos a un medio nuevo cada tres días durante dos semanas para evitar la muerte del explante (figura 1b). Se observó formación de nuevos brotes en pocos explantes después de cinco semanas (figura 1c). Después de 12-15 semanas, la emisión fenólica se detuvo, los nuevos brotes emergentes y las hojas se acortaron en tamaño, los órganos se volvieron verdes y los brotes nuevos enrojecidos mostraron un patrón de crecimiento radial.

Tabla 1. Establecimiento in vitro de explantes de caña flecha (G. sagittatum) Criolla 1 y Martinera 

Fuente: Elaboración propia

Fotos: Claudia López Díaz

Figura 1. Proceso de establecimiento in vitro de explantes de caña flecha (G. sagittatum) en un medio MS (^{Murashige & Skoog, 1962}) semisólido con sales principales. a. Una semana después del establecimiento; b. Dos semanas después del establecimiento; c. Cuatro semanas después del establecimiento; d. Ocho semanas después del establecimiento. 

Multiplicación de brotes

Las plantas multiplicadas in vitro mostraron un patrón de crecimiento radial desde un punto central interior hacia la periferia, sin evidencia de crecimiento de brotes adventicios (figura 2).

Fotos: Claudia López Díaz

Figura 2. Crecimiento y multiplicación de brotes de caña flecha a partir de explantes con meristemos preexistentes cultivados en un medio MS (^{Murashige & Skoog, 1962}) en doble fase con adición de 0,5mg/L de BAP después de seis (izquierda) y ocho (derecha) semanas de cultivo en un medio de multiplicación. 

El ANOVA permitió detectar que el cultivar, los niveles de BAP y la interacción entre ambos influyeron estadísticamente (Pr < 0,05) en la formación de nuevos brotes. Según la prueba de Tukey, las tasas más altas de formación de nuevos brotes se dieron en los explantes de los cultivares Criolla (28,2), Martinera (21,2) y Criolla 1 (10) (tabla 2) cuando los explantes se cultivaron en un medio con 0,5 mg/L de BAP, aunque para el cultivar Criolla 1 no hubo diferencias estadísticas entre los brotes cultivados en presencia o ausencia de BAP. Las tasas de multiplicación más bajas se presentaron para todos los cultivares cuando los explantes se cultivaron en un medio sin suministro de BAP. El nivel de BAP por encima de > 0,5mg/L redujo de forma drástica la formación de nuevos brotes (tabla 2, figura 3).

Tabla 2. Efecto de BAP sobre la multiplicación de brotes in vitro (desviación estándar) y longitud de brotes en cm (desviación estándar) de caña flecha (G. sagittatum) cv. Criolla, Criolla 1 y Martinera 

Fuente: Elaboración propia

Foto: Claudia López Díaz

Figura 3. Multiplicación de brotes de caña flecha (G. sagittatum) a partir del explante con meristemas preexistentes de Criolla (izquierda), Criolla 1 (centro) y Martinera (derecha), después de cuatro semanas de cultivo en un medio MS en doble fase con adición de 0,5 mg/L de BAP. 

Para la longitud de los brotes, el ANOVA permitió detectar diferencias estadísticas (Pr < 0,05) entre todos los tratamientos. Los brotes más largos (10,8cm) crecieron a partir de brotes de Criolla cultivados con 0,5mg/L de BAP; sin embargo, no fueron estadísticamente diferentes de los brotes de Criolla 1 y Martinera cultivados al mismo nivel de BAP. Los datos recolectados mostraron una correlación positiva (r = 0,78) entre la longitud de los brotes y el nivel de BAP en el medio (figura 3, tabla 2).

Enraizamiento in vitro

Los cultivos de todos los cultivares desarrollaron raíces, de manera que se observó un 100% de enraizamiento para todos los tratamientos; no obstante, el ANOVA permitió detectar diferencias estadísticas (Pr < 0,05) entre tratamientos debido a los cultivares, los niveles de NAA y la interacción entre estos dos factores. Los brotes cultivados en medios con adición de NAA desarrollaron un mayor número de raíces que los cultivados en ausencia de NAA. El número de raíces adventicias por explante fue mayor para la mayoría de los cultivares cuando al medio se le añadió 1,0mg/L de NAA; sin embargo, un nivel de NAA mayor de 1,0mg/L redujo el número de raíces adventicias (tabla 3, figura 4).

Tabla 3. Formación de raíces adventicias in vitro (desviación estándar) y longitud de la raíz en cm (desviación estándar) de cultivos de caña flecha (G. sagittatum) cv. Criolla, Criolla 1 y Martinera en un medio con adición de NAA 

Fotos: Claudia López Díaz

Figura 4. Enraizamiento de brotes de caña flecha (G. sagittatum) cv. Criolla (izquierda), Criolla 1 (centro) y Martinera (derecha), cultivados in vitro después de cuatro semanas de cultivo en un medio MS con adición de 1,0 mg/L de NAA. 

La longitud de las raíces adventicias se vio afectada estadísticamente por el suministro de NAA en el medio (Pr < 0,05). La prueba de Tukey mostró que las raíces más largas para Criolla 1 (6cm), Martinera (3,8cm) y Criolla (3,66cm) se presentaron en brotes cultivados en un medio sin suministro de NAA; por el contrario, las raíces siempre se acortaron cuando los explantes se cultivaron en un medio con suministro de NAA. Las raíces cultivadas en NAA se redujeron proporcionalmente con una mayor concentración de NAA (figura 4, tabla 3).

Aclimatación

Las plantas enraizadas in vitro de todos los cultivares y los brotes micropropagados de la etapa de multiplicación mostraron una supervivencia completa (100%) y una adaptación total cuando se transfirieron a condiciones ex vitro. Cuatro semanas después de la transferencia, las plantas estaban sanas, presentaban color verde y crecían activamente sin tejidos muertos, áreas necróticas ni crecimiento adventicio (figura 5).

Fotos: Claudia López Díaz

Figura 5. Adaptación ex vitro de las plantas micropropagadas de caña flecha (G. sagittatum) Criolla, Criolla 1 y Martinera. 

La micropropagación es una técnica de propagación de plantas clonales que permite producir nuevas plantas a partir de propágulos de pequeño tamaño (explantes) en un entorno aséptico, con condiciones ambientales controladas y crecimiento heterotrófico, entre otras características (^{Choudhary et al., 2015}; ^{Lodha et al., 2015}). La micropropagación a partir de explantes con meristemas preexistentes es uno de los métodos de micropropagación más utilizados en la producción de material vegetal comercial debido a su estabilidad genética y fenotípica y a las altas tasas de multiplicación para la mayoría de las especies de plantas (^{Choudhary et al., 2015}; ^{Hassan, 2017}).

La micropropagación de meristemas preexistentes se basa en la adición de citoquininas a los medios de cultivo para interrumpir la dominancia apical e inducir la elongación repetitiva de los brotes axilares (^{Quiroz et al., 2017}; ^{Yavuz, 2016}). Los datos obtenidos a partir de la presente investigación mostraron que, independientemente del genotipo, la multiplicación de brotes de caña flecha en un sistema de doble fase con 0,5mg/L de BAP aumentó estadísticamente en los cultivares Criolla y Martinera en comparación con los cultivados en ausencia de BAP. Los informes anteriores sobre la micropropagación de la caña flecha utilizando medios de sistemas semisólidos son consistentes con un aumento de los efectos de BAP en la multiplicación de brotes de meristemas preexistentes (^{Pastrana & Suárez, 2009}; ^{Suárez et al., 2009}).

El cultivar Criolla 1 evidenció la tasa de multiplicación más baja (diez nuevos brotes por explante) entre los tres cultivares con esta concentración de BAP. Sin embargo, incluso para este cultivar, la tasa de multiplicación observada, con una frecuencia de cuatro semanas para subcultivos, puede convertirse en un método eficaz de propagación de plantas. Además, dado que la etapa de multiplicación de brotes empleó un medio en doble fase, otros factores deben considerarse provechosos para este protocolo: menores costos en agentes gelificantes, menos mano de obra, menor contaminación del cultivo y menor estrés de la planta. Esto puede resultar en un protocolo de micropropagación más eficiente para plantas de caña flecha (^{López & Suárez, 2018}).

Uno de los propósitos de la multiplicación de brotes a partir de meristemas preexistentes es obtener nuevos brotes que puedan enraizarse de manera eficiente y soportar condiciones ex vitro para la adaptación en el campo (^{Lodha, 2015}; ^{Quiroz et al., 2017}; ^{Senapati, 2015}). El tamaño de los brotes es fundamental en el almacenamiento de reservas de energía para la formación de raíces adventicias y el desarrollo de nuevos órganos cuando se transfieren a condiciones ex vitro (^{Kane, 1996}; ^{Suárez Padrón, 2020}). Los brotes multiplicados de caña flecha en un sistema de medio convencional semisólido con 0,5mg/L de BAP midieron en promedio 3cm de largo (^{Pastrana & Suárez, 2009}), mientras que, en la presente investigación, los brotes con el mismo suministro de BAP fueron tres veces más grandes (9cm). Se observaron resultados similares al comparar brotes de piña Ananas comosus L. (Bromeliaceae) (^{Scherwinski-Pereira et al., 2012}) y de caña flecha G. sagittatum (^{López & Suárez, 2018}; ^{Suárez-Padrón et al., 2020}) cultivados en medios semisólidos y en medios bifásicos. El aumento del tamaño de los brotes se asocia con una mayor acumulación de reservas de energía, lo que genera más posibilidades de supervivencia cuando se transfieren a condiciones ex vitro y un mejor desempeño de la planta durante la fase inicial de crecimiento y desarrollo en el campo (^{Almeida do Vale et al., 2019}; ^{Espinosa-Reyes et al., 2019}).

La raíz es el órgano que permite la absorción de agua y nutrientes y estabiliza la planta en el sustrato (^{Quiroz et al., 2017}; ^{Senapati, 2015}). En condiciones in vitro, el medio vegetal y el medio ambiente evitan la deshidratación del tejido vegetal y favorecen la absorción de nutrientes sin formación de raíces. No obstante, para condiciones ex vitro, el enraizamiento in vitro proporciona los mecanismos para el crecimiento y desarrollo normales de la planta en condiciones de campo abierto (^{Choudhary et al., 2017}; ^{Zakavi et al., 2016}). Por lo general, la formación de raíces adventicias in vitro se promueve mediante el suministro de auxinas en el medio de cultivo (^{Ozdemir et al., 2014}; ^{Resende et al., 2016}). La presente investigación mostró que el suministro de NAA en el medio aumentó estadísticamente la inducción de la formación de raíces adventicias en los brotes de caña flecha micropropagados para todos los cultivares. Los brotes cultivados en un medio con adición de NAA formaron tres veces más raíces que los cultivados en ausencia de NAA; la respuesta aumentó incluso en comparación con estudios previos de enraizamiento in vitro con caña flecha (^{Pastrana & Suárez, 2009}; ^{Suárez et al., 2009}).

El enraizamiento in vitro de buena calidad no solo se relaciona con la formación y proliferación de raíces adventicias, sino también con características de la raíz como la longitud y el ancho (^{Benavides et al., 2016}; ^{Rodríguez et al., 2015}; ^{Zakavi et al., 2016}). Durante la transferencia a condiciones ex vitro, los brotes con raíces más cortas son fáciles de manipular y no requieren recorte, lo que produce estrés y heridas abiertas (^{Kane, 1996}). Las raíces formadas en medios con suministro de NAA fueron un 50% más cortas que las cultivadas en medios privados de NAA, lo que redujo la longitud de la raíz a medida que aumentaron los niveles de NAA para todos los cultivares, un patrón que parece ser similar para la mayoría de las especies de plantas cultivadas in vitro.

La cuarta etapa de la micropropagación está destinada a brindar a las plantas micropropagadas las condiciones ambientales óptimas para resistir la transición de un modelo de crecimiento heterótrofo (in vitro) a uno autótrofo (ex vitro) (^{Ozdemir et al., 2014}; ^{White et al., 2016}). La baja competencia fotosintética es uno de los factores limitantes más severos para que las plantas cultivadas in vitro de forma convencional se adapten a las condiciones externas del campo. Los cultivos in vitro no son activamente fotosintéticos, ya que la intensidad de la luz no puede activar la función del cloroplasto en condiciones normales in vitro; por lo tanto, se debe agregar sacarosa al medio de cultivo como fuente de energía (^{Seon et al., 2000}; ^{Tisarum et al., 2018}). La disfunción del cloroplasto permanece cuando las plantas se transfieren a condiciones ex vitro y es necesaria la formación de nuevos órganos, específicamente hojas, para activar la fotosíntesis y la nutrición autótrofa. Dado que no se producen carbohidratos u otra fuente energética, la energía requerida para la formación de nuevos órganos proviene de las reservas acumuladas durante el crecimiento in vitro (^{Lata et al., 2016}; ^{Nunes et al., 2016}). El presente estudio mostró que los brotes cultivados en doble fase eran tres veces más grandes que los micropropagados en sistemas de medios semisólidos convencionales informados en otros estudios (^{Pastrana & Suárez, 2009}; ^{Suárez Padrón, 2020}), lo que aumenta su capacidad para la formación de nuevos órganos y su habilidad para desempeñarse mejor durante la transición in vitro-ex vitro.

Un segundo factor limitante para las plantas cultivadas in vitro transferidas a condiciones ex vitro es la deshidratación rápida y severa de los tejidos (^{Kumari et al., 2017}; ^{Mozafari et al., 2015}). Las plantas in vitro se mantienen en una atmósfera cerrada saturada de agua y se establecen en un medio de cultivo con > 90% de agua. Este ambiente totalmente húmedo evita la activación de mecanismos como el cierre de estomas y la acumulación de cutículas, destinadas a evitar la deshidratación. Como la estructura foliar in vitroes propensa a una rápida deshidratación cuando se transfiere a ex vitro, las plantas deben colocarse en un ambiente con alta saturación de agua (sistemas de riego vaporizado) y baja intensidad de luz (umbráculo), con el fin de evitar la pérdida de plantas (^{Bukhari et al., 2016}; ^{Zakavi et al., 2016}). En la presente investigación, independientemente del cultivar y de la etapa de micropropagación (multiplicación de brotes o enraizamiento in vitro), los cultivos transferidos a condiciones ex vitro se adaptaron por completo y sobrevivieron (100% de supervivencia), como se informó en estudios previos (^{Pastrana & Suárez, 2009}; ^{Suárez et al., 2009}).

La etapa de enraizamiento in vitro es la más costosa del protocolo de micropropagación debido a los gastos de auxina, la mano de obra, las cantidades de medio de cultivo y los reactivos. Por otra parte, la transferencia de la etapa de multiplicación a la de enraizamiento aumenta el riesgo de contaminación, el estrés de los tejidos y el tiempo de cultivo. La transferencia directa de brotes de la etapa de multiplicación a la adaptación ex vitro reduce los costos y el tiempo, a la vez que mantiene las tasas de supervivencia y la calidad de la planta. El desempeño de los brotes enraizados y no enraizados cuando se transfieren a condiciones ex vitro demostró que el enraizamiento in vitro es innecesario para que las plantas micropropagadas se adapten a las condiciones ex vitro, lo que indica que la transferencia ex vitro desde la etapa de multiplicación se puede realizar sin implicaciones para la supervivencia de la planta. En cambio, es posible acortar el tiempo para la producción de la planta y reducir los costos.

El presente protocolo para la micropropagación de la caña flecha Criolla, Criolla 1 y Martinera, utilizando un medio en doble fase y la transferencia de brotes directamente desde la etapa de multiplicación a la adaptación ex vitro, permite la producción en masa de plantas de alta calidad a partir de pocos explantes establecidos in vitro en un periodo relativamente corto.